覃紅菊，吳心雨，肖 強(qiáng)*

(1.湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

尖葉四照花(Cornuselliptica)是山茱萸科(Cornaceae)四照花屬(Cornus)常綠喬木，又稱為山荔枝、野荔枝、石棗等.當(dāng)前，學(xué)者對(duì)尖葉四照花植物的開發(fā)利用大多聚焦于觀賞價(jià)值、果實(shí)食用性、藥用價(jià)值等方面.對(duì)尖葉四照花化學(xué)成分的研究，主要圍繞多酚類、環(huán)烯醚萜苷、三萜、甾醇及有機(jī)酸類化合物進(jìn)行[1-2]；但對(duì)于尖葉四照花葉片中具有重要生物活性的多糖物質(zhì)的研究則未見報(bào)道.

多糖即多聚糖(polysaccharide)，廣泛分布在動(dòng)、植物細(xì)胞中，由聚合度超過(guò)10個(gè)單糖以上的聚糖組成.多糖來(lái)源廣泛，是高等植物和動(dòng)物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁中的重要組成物質(zhì)[3].研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]及其他多種生物活性[7].目前香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖已在國(guó)內(nèi)外臨床上廣泛應(yīng)用，其他多糖也正在深入研究與開發(fā)中[8].在多糖研究中，快速測(cè)定樣品的多糖含量，對(duì)于高效優(yōu)化多糖提取、純化工藝具有重要應(yīng)用價(jià)值；目前常用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖含量,但該法存在耗時(shí)長(zhǎng)、試劑腐蝕性高等缺陷.

近年來(lái)熒光光譜法作為一種新的光譜分析方法[9-10]，在生物大分子以及離子締合物的分析中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，可以用于多糖[11]、核酸[12]、蛋白質(zhì)[13]、無(wú)機(jī)離子[14]等的測(cè)定.熒光光譜法能檢測(cè)出許多分光光度法無(wú)法檢測(cè)的物質(zhì)，并且所需試劑易得、操作簡(jiǎn)單易行、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少，有利于對(duì)微量樣品的測(cè)定[15].因此本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法測(cè)定尖葉四照花葉片多糖含量，為后續(xù)對(duì)該多糖的分離純化提供高效的多糖檢測(cè)手段；并在此基礎(chǔ)上，開展該多糖的體外抗氧化測(cè)定，為實(shí)現(xiàn)尖葉四照花葉片多糖的有效開發(fā)提供初步依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

尖葉四照花葉片采自湖北省恩施市湖北民族大學(xué)，葉片鮮綠成熟無(wú)病害.清洗后，烘干、粉碎、過(guò)80目篩后貯存在干燥器中密封備用.

試劑包括石油醚、無(wú)水乙醇、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、濃硫酸、氫氧化鈉(NaOH)、葡聚糖凝膠G-100、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗壞血酸(Vc).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

儀器包括熒光分光光度計(jì)(日本日立公司，F(xiàn)-4600)、紫外-可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，TU-1901)、低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，H2050R)、冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司，ALPHA1-2LD)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技有限公司,HH-2).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 尖葉四照花葉片多糖的制備

稱取10 g經(jīng)脫脂、脫單糖的尖葉四照花葉片粉末，按1∶20(g/mL)的料液比加入超純水，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為3 h，冷卻后離心，離心溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，時(shí)間為20 min.取上清液，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，醇沉過(guò)夜，離心后取沉淀，加10 mL蒸餾水溶解得到尖葉四照花葉片粗多糖，然后使用木瓜蛋白酶[10]和TCA溶液[16-17]進(jìn)行脫蛋白處理得所需樣品液.使用葡聚糖凝膠柱純化樣品液，得到純化后的多糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2 熒光光譜法測(cè)定葉片多糖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將尖葉四照花葉片純化多糖按梯度配置成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.按照“2.2.1測(cè)定方法”，做3次平行實(shí)驗(yàn)，橫軸為多糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度(c，μg/mL)，縱軸為共振光散射強(qiáng)度(ΔIRLS)，得出多糖的線性方程:ΔIRLS=84.472c+23.24，R2=0.997 1，線性范圍為3～18 μg/mL.

2.2.3 波長(zhǎng)與表面活性劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)將從CPC、CTAB、SDBS 3種表面活性劑中比較選擇.比較200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，不同表面活性劑與多糖結(jié)合后在NaOH溶液中的共振光散射強(qiáng)度及其單獨(dú)在NaOH溶液中的共振光散射強(qiáng)度，選用共振光散射強(qiáng)度差值最大的物質(zhì)作為最佳表面活性劑，選用最佳表面活性劑下的最大散射波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng).

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 NaOH溶液濃度對(duì)ΔIRLS的影響 按照“2.2.1測(cè)定方法”，分別選取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mol/L不同濃度梯度的NaOH溶液，其他條件均相同，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).當(dāng)NaOH溶液濃度為0.9 mol/L時(shí)，ΔIRLS最大，故NaOH溶液最佳濃度為0.9 mol/L.

2.3.2 CTAB溶液濃度對(duì)ΔIRLS的影響 按照“2.2.1測(cè)定方法”，分別選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L不同濃度梯度的CTAB溶液，其他條件均相同，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).當(dāng)CTAB溶液濃度為3.0 mmol/L時(shí)，ΔIRLS最大，故CTAB溶液最佳濃度為3.0 mmol/L.

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)ΔIRLS的影響 按照“2.2.1測(cè)定方法”，分別選取10、20、30、40、50、60 min的反應(yīng)時(shí)間，其他條件均相同，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，ΔIRLS最大.故最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為30 min.

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平Tab.1 Orthogonal experiment level

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

基于最佳波長(zhǎng)及表面活性劑的選擇，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以 NaOH溶液濃度(A)、CTAB溶液濃度(B)和反應(yīng)時(shí)間(C)為自變量，以ΔIRLS為因變量.確定熒光光譜法測(cè)定尖葉四照花葉片多糖含量的最優(yōu)反應(yīng)條件，如表1所示.

2.5 苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖含量

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別取1 mL置于具塞試管中，再分別加入1 mL 6% 苯酚溶液，搖勻后再加濃硫酸5.0 mL，混合均勻后置于90 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱15 min，冷卻至室溫，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[18].得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.008 3x+0.015 7，R2=0.998 7.

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 分別取2 mL多糖溶液、2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min 后，5 000 r/min 離心10 min，測(cè)定其上清液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度A1，同時(shí)測(cè)定樣品溶液在517 nm處的吸光度Ax及DPPH溶液在517 nm處的吸光度A2[19]；以同等濃度Vc作為陽(yáng)性對(duì)照組，平行測(cè)定3次.清除率計(jì)算公式為：ADPPH?=[1-(A1-Ax)/A2]×100%.式中：ADPPH?表示DPPH自由基清除率.

圖1 CPC體系IRLS光譜Fig.1 CPC system IRLS spectroscopy

3 結(jié)果與分析

3.1 波長(zhǎng)及表面活性劑的選擇

本研究對(duì)CPC、CTAB、SDBS 3種表面活性劑進(jìn)行比較，如圖1～3所示.由于尖葉四照花葉片多糖為酸性多糖，帶有陰離子，CTAB和CPC表面活性劑為陽(yáng)離子，在靜電作用下他們會(huì)互相結(jié)合形成體積較大的粒子，而SDBS為陰離子表面活性劑，尖葉四照花葉片多糖與其結(jié)合較難或無(wú)法結(jié)合.由瑞利散射公式[21]可知，粒子體積越大，共振光散射越強(qiáng).所以CTAB體系下的共振光散射強(qiáng)度大于CPC體系且遠(yuǎn)大于SDBS體系.因此選擇CTAB為表面活性劑，選用CTAB體系下的最大散射波長(zhǎng)370 nm作為熒光光譜法的測(cè)定波長(zhǎng).

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1) NaOH溶液濃度對(duì)ΔIRLS的影響如圖4所示.當(dāng)NaOH溶液濃度逐漸升高時(shí)，ΔIRLS先升后降，最適濃度為0.9 mol/L.這是由于適當(dāng)?shù)膲A性條件可以誘導(dǎo)尖葉四照花葉片多糖產(chǎn)生更多的負(fù)電荷，增強(qiáng)其與CTAB表面活性劑之間的靜電作用.當(dāng)NaOH濃度大于最適濃度后，堿性強(qiáng)度超過(guò)尖葉四照花葉片多糖可承受范圍就會(huì)使尖葉四照花葉片多糖降解，導(dǎo)致ΔIRLS下降.此結(jié)果與成芳等[22]得出的熒光光譜法測(cè)紅豆杉葉片的最佳NaOH溶液濃度為1 mol/L相近，證明這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可行性.

圖2 CTAB體系IRLS光譜圖3 SDBS體系IRLS光譜 Fig.2 CTAB system IRLS spectroscopy Fig.3 SDBS system IRLS spectroscopy

2) CTAB溶液濃度對(duì)ΔIRLS的影響如圖5所示.CTAB最適濃度為3.0 mmol/L，當(dāng)CTAB溶液濃度升高時(shí)，ΔIRLS先升高后下降.這是由于隨著CTAB濃度的升高，其與尖葉四照花葉片多糖結(jié)合形成的粒子締合物也就越多，而CTAB溶液濃度超過(guò)最適濃度時(shí)分子可能發(fā)生自聚合作用，與多糖的締合作用減弱，就會(huì)導(dǎo)致共振光散射強(qiáng)度差值(ΔIRLS)下降.此結(jié)果與郭宗寧等[23]通過(guò)共振光散射法測(cè)定核酸的實(shí)驗(yàn)中CTAB溶液濃度的最佳條件0.1 mmol/L有較大差距，可能是由于多糖、核酸與CTAB結(jié)合程度不同導(dǎo)致的.

圖4 NaOH溶液濃度對(duì)共振光散射強(qiáng)度的影響圖5 CTAB溶液濃度對(duì)共振光散射強(qiáng)度的影響

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)共振光散射強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of reaction time on the intensity of resonance light scattering

3) 反應(yīng)時(shí)間對(duì)ΔIRLS的影響如圖6所示.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間逐漸增加時(shí)，ΔIRLS先升高后下降，但在10～60 min的反應(yīng)時(shí)間里，共振光散射強(qiáng)度基本穩(wěn)定，最適反應(yīng)時(shí)間為30 min.朱夢(mèng)等[24]通過(guò)熒光光譜法測(cè)異煙肼多糖的實(shí)驗(yàn)中最佳反應(yīng)時(shí)間為25 min，與本實(shí)驗(yàn)基本相同.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，ΔIRLS有所下降可能是由于空氣中的氧氣長(zhǎng)時(shí)間接觸尖葉四照花葉片多糖發(fā)生氧化.

3.3 正交實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)(3因素3水平)(L33)，如表2所示.由表2可知，對(duì)ΔIRLS的影響主次順序?yàn)椋篘aOH溶液濃度>CTAB溶液濃度>反應(yīng)時(shí)間，對(duì)ΔIRLS的各影響因素3個(gè)水平間優(yōu)勢(shì)為：A2>A3>A1，B2>B1>B3，C2>C1>C3.所以最優(yōu)反應(yīng)條件為：0.9 mol/L NaOH溶液，3.0 mmol/L CTAB溶液，30 min反應(yīng)時(shí)間.以上述條件進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn).測(cè)得ΔIRLS分別為1 396.3、1 413.7、1 409.5,平均值為1 406.5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%，小于5.0%，說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有科學(xué)性.

表2 L33正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 L33 orthogonal test results

表3 ΔIRLS法與苯酚-濃硫酸法測(cè)定結(jié)果比較Tab.3 Comparison of ΔIRLS method and phenol sulfuric acid method

3.4 不同測(cè)定方法結(jié)果比較

ΔIRLS法與苯酚-濃硫酸法含量測(cè)定結(jié)果比較如表3所示.由表3可知，采用熒光光譜法測(cè)定尖葉四照花葉片多糖平均含量為28.13±0.15 mg/g，苯酚-硫酸法測(cè)定尖葉四照花葉片多糖平均含量為31.27±0.46 mg/g，結(jié)果差距不大，證明熒光光譜法測(cè)定尖葉四照花葉片多糖含量的方法具有可行性.

3.5 多糖抗氧化活性

圖7 尖葉四照花葉片多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用 圖8 尖葉四照花葉片多糖對(duì)自由基的清除作用

4 結(jié)論