許 姣，湯建磊，李小虹（通信作者）

（1 江蘇大學附屬武進醫(yī)院<徐州醫(yī)科大學武進臨床學院>呼吸與危重癥醫(yī)學科 江蘇 常州 213000）

（2 江蘇大學附屬武進醫(yī)院<徐州醫(yī)科大學武進臨床學院>重癥監(jiān)護室 江蘇 常州 213000）

（3 江蘇大學附屬武進醫(yī)院<徐州醫(yī)科大學武進臨床學院>醫(yī)學檢驗科 江蘇 常州 213000）

肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，2 0 1 8 GLOBOCAN 的數據顯示，全球新發(fā)肺癌患者約209 萬例，死亡176 萬例[1]，我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9%，2015年新診斷肺癌73.3萬例，61萬人死于肺癌[2]。在腫瘤微環(huán)境中，細胞程序性死亡受體1（PD-1）及其配體PD-L1 結合開啟腫瘤免疫抑制程序，是免疫調節(jié)的重要組成部分。T 細胞是抗腫瘤免疫應答中的核心執(zhí)行者，腫瘤細胞的PD-L1 蛋白與T 細胞上的PD-1 受體結合可傳導抑制信號，限制T 細胞的活化、增殖、細胞毒性及細胞因子的分泌，下調抗腫瘤免疫應答，開啟免疫逃逸。以納武利尤單抗、帕博利珠單抗等為代表的PD1 抑制劑成為非小細胞肺癌（NSCLC）的治療新選擇[3-4]。因此，篩選免疫治療的最有效預測因子的研究亟需進一步開展。ST2（生長刺激表達基因2 蛋白）位于2 號染色體，可編碼ST2L、sST2、ST2V 和ST2LV 蛋白[5-6]。ST2L 主要表達于Th 細胞、Treg 細胞等參與細胞增殖，而sST2 可能起到負性作用[7]。本研究者前期研究已證實NSCLC 癌組織中ST2 基因和ST2 蛋白高表達，且在非小細胞肺癌中ST2 介導了Th1/Th2 細胞因子漂移[8]。但目前免疫治療的療效預測標記物尚未明確，腫瘤組織中PD-L1 表達水平、錯配基因修復蛋白（MMR）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）、腫瘤組織的突變負荷（TMB）等都可成為免疫治療療效的預測指標，但其預測能力尚存爭議[9-10]。本研究旨在探討晚期非小細胞肺癌患者抗PD-1 治療前后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、ST2L 水平變化，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1 月—2022年1 月江蘇大學附屬武進醫(yī)院行抗PD-1 治療的晚期非小細胞肺癌患者30 例為肺癌組，選取同期30 名體檢健康者作為對照組。肺癌組男2 2例，女8 例；≥8 0歲7 例，＜8 0歲2 3例；吸煙≥600 支/年者20 例，＜600 支/年者10 例。對照組中男2 2例，女8 例；≥8 0歲5 例，＜8 0歲2 5例；吸煙≥600 支/年者18 例，＜600 支/年者12 例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求。

納入標準：①肺癌組病理組織學明確診斷為非小細胞肺癌（NSCLC）；②EGFR、ALK 陰性NSCLC；③ECOG 評分0 ～2 分。排除標準：①既往合并嚴重肝腎功能損害；②患有自身免疫系統(tǒng)疾病。所有患者均接受至少2 周期抗PD-1 治療，并簽署知情同意書。

1.2 方法

（1）TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）數據庫。TIMER 數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析提示在NSCLC 中ST2 與CD4+T 細胞、CD8+T 細胞的相關性，通過ssGSEA 方法，得到每個樣品中免疫相關基因集打分（免疫基因集包括免疫細胞類型、功能和通路）。通過聚類分析，將樣品分為兩組，即高免疫組（Immunity_H）、低免疫組（Immunity_L），然后分析每個免疫組ST2 的表達水平，發(fā)現ST2 可能和免疫治療療效密切相關。具體步驟：①通過TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載和整理數據；②ssGSEA 分析，得到每個樣品免疫打分；③根據ssGSEA 打分，對樣品分組，得到2 個免疫分組（Immunity_H、Immunity_L）；④免疫分組和ST2 的相關性。（2）治療方法。肺癌組患者均接受PD-1單抗治療，用藥方法：信迪利單抗200 mg/次靜滴，21 d為1 個周期或替雷利珠單抗200 mg/次靜滴，21 d 為1 個周期或卡瑞利珠單抗200 mg/次靜滴，14 d 為1 個周期。

1.3 觀察指標

檢測外周血CD4+、CD8+、ST2L 對照組、肺癌組患者在第1 次抗PD-1 治療前及抗PD-1 治療2，4周期后，空腹抽取外周血5 m L，EDTA 抗凝管，嚴禁冷藏用，SemiBio 細胞免疫芯片檢測CD4+、CD8+；離心取細胞，BSP005 提取膜蛋白，凍存于-20 ℃。按照ELISA 操作步驟，檢測ST2L。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數據處理。符合正態(tài)分布的計量資料采用（± s）表示，多組間比較行t檢驗；若不符合正態(tài)分布，采用中位數和四分位數［M（Q1，Q3）］表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗；計數資料用頻數（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 TIMER 數據庫分析ST2 與CD4+T 細胞、CD8+T 細胞浸潤相關

TIMER 數據庫顯示ST2 和CD4+T 細胞、CD8+T 細胞浸潤呈正相關（P＜0.05），見圖1。

圖1 ST2 和CD4+T 細胞、CD8+T 細胞浸潤相關性分析

2.2 通過ssGSEA（single sample GSEA）發(fā)現ST2可能和免疫治療療效相關

通過ssGSEA（single sample GSEA）方法，發(fā)現ST2可能和免疫治療療效密切相關（P＜0.05，0.001，0.01，0.05“***”，“**”，“*”），見圖2。

圖2 ST2 與免疫治療療效相關性分析

2.3 各組外周血T 淋巴細胞亞群比較

肺癌組抗PD-1 治療前后外周血CD4+細胞水平、CD4+/CD8+均低于對照組，而CD8+細胞水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；抗PD-1 治療后外周血CD4+細胞水平、CD4+/CD8+較治療前有升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療前后，CD8+細胞水平變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組外周血T 淋巴細胞亞群比較（ ± s，個/微升）

表1 各組外周血T 淋巴細胞亞群比較（ ± s，個/微升）

注：肺癌組抗PD1 治療前后兩組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與對照組比較，aP ＜0.05；肺癌組抗PD1 治療后CD4+、CD4+/CD8+與抗PD1 治療前比較，bP ＜0.05。

組別 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+肺癌組治療前 400.63±48.14a 808.33±200.8a 0.52±0.13a肺癌組治療后 539.93±169.09ab 720.67±131.17a 0.80±0.40ab對照組 998.33±428.85 612.67±247.93 1.61±0.47

2.4 各組外周血ST2L 的表達

與對照組相比，抗PD-1 治療前后NSCLC 外周血低表達ST2L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且抗PD-1治療后NSCLC 外周血ST2L 表達量較治療前有明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組外周血ST2L 的表達

3.討論

有效的免疫反應需要腫瘤細胞和T 細胞的刺激信號和免疫抑制相互作用維持T 細胞激活狀態(tài)啟動殺腫瘤細胞過程[11]。重塑并激活腫瘤微環(huán)境中的免疫作用，逆轉T 細胞耗竭，增強免疫細胞殺死腫瘤細胞的能力是目前PD-1/PD-L1 抑制劑抗腫瘤的作用基礎。本實驗研究表明NSCLC 外周血CD4+細胞水平、CD4+/CD8+均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示NSCLC 患者存在免疫功能抑制?？筆D-1 治療后NSCLC 外周血CD4+細胞水平、CD4+/CD8+較抗PD-1 治療前有顯著增加，提示抗PD-1 治療后NSCLC 免疫抑制有所改善（如表1）。本研究通過生物信息學方法分析，發(fā)現ST2 與CD4+T 細胞、CD8+T 細胞浸潤相關。與健康人群比較，NSCLC 外周血低表達ST2L，抗PD-1 治療后外周血ST2L 表達量明顯增多，提示ST2L 的表達與PD1 治療相關，進一步證實了ssGSEA（single sample GSEA）方法發(fā)現的ST2 可能和免疫治療療效相關。

NSCLC 外周血低表達ST2L 與前期實驗結果不一致，分析可能原因為：①前期實驗檢測的為ST2 基因，本實驗僅檢測了T 細胞表面的ST2L，推測NSCLC 患者免疫功能低下且大部分T 細胞被募集至肺癌病灶中發(fā)揮抗腫瘤作用，需要進一步實驗驗證。②本樣本量較小，需要擴大樣本進一步驗證?？筆D-1 治療后NSCLC 外周血ST2L較治療前增多，結合抗PD-1 治療后NSCLC 外周血CD4+細胞水平升高，推測表達于Th 細胞表面的ST2L 可能作為非小細胞肺癌免疫療效預測標志物，需要進一步展開研究。