鐘 玥，蘇永昌，陳由強(qiáng)，陳建楠*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建 福州 350117；3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013)

威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)是一種典型的中心綱浮游硅藻[1]，體積小，生長周期短，由無定型二氧化硅組成的細(xì)胞壁硅質(zhì)化程度高，生存能力較強(qiáng)，在海洋硅藻中分布較廣[2-3]。作為硅藻生理學(xué)研究的代表藻株，威氏海鏈藻很早就被用于攝食率的實驗[4]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，是重要的魚蝦類餌料[5]，可促進(jìn)某些蝦類幼苗的生長和發(fā)育[6]，也可調(diào)節(jié)某些軟體動物的生長[7]。

巖藻黃素(Fucoxanthin)，亦稱褐藻素、墨角黃素，是一種脂溶性橙色色素，為胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于類胡蘿卜素中的葉黃素類[8]。硅藻因含有大量巖藻黃素而呈現(xiàn)金褐色，是硅藻類植物的指標(biāo)性色素[9]。巖藻黃素分子式為C42H58O6，含有5，6-單環(huán)氧基、9-共軛雙鍵以及羰基和羥基[10]，由于這些功能基團(tuán)的存在，巖藻黃素易被氧化和異構(gòu)化，因此其具有光不穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性[8]。各種研究表明，巖藻黃素具有抗氧化活性及很強(qiáng)的自由基清除能力[8，11]，此外，還具有抗肥胖[12]、抗糖尿病[13]、抗炎[14-15]以及抗腫瘤[16]等作用。

海洋微藻中巖藻黃素提取的傳統(tǒng)方法為有機(jī)溶劑浸提法，Wang W J等[17]用二甲基亞砜(DMSO)將海帶置于黑暗中浸提，再以乙酸乙酯和硫酸銨混合溶液將浸提液中得到的色素萃取到乙酸乙酯中。由于有機(jī)溶劑提取法具有一定的局限性，因此現(xiàn)今各種新型提取技術(shù)也在不斷研究中，如超臨界CO2萃取技術(shù)[18-19]、微波萃取法[20]、加壓溶劑萃取法[21]、超聲波提取法[22]、酶提法[23]等。對分離純化后得到的巖藻黃素進(jìn)行檢測鑒定，采用的方法通常有超高效液相色譜(UPLC)[24]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[25]和核磁共振技術(shù)(NMR)[26]。

營養(yǎng)鹽是海洋微藻生長的重要生態(tài)因子，影響著藻類生物的生理活動和生化組成，以及其種群的生長和繁殖[27-28]。其中，氮、磷營養(yǎng)鹽是海水的主要組分，近年來，有關(guān)氮、磷限制對海洋微藻生長及生化組成的影響已有許多進(jìn)展。研究表明，氮是藻細(xì)胞中光合作用的必需元素，當(dāng)?shù)獱I養(yǎng)鹽不足時，藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素總量減少，光反應(yīng)中心蛋白合成減少，光能的利用效率降低，影響微藻的生長與繁殖[29]；無機(jī)磷在微藻細(xì)胞中合成有機(jī)磷化合物，參與合成ATP、GTP、輔酶等光合作用所需的底物或調(diào)節(jié)物[30-31]。夏建榮等[29]研究發(fā)現(xiàn)，小新月菱形藻細(xì)胞的比生長速率和穩(wěn)定期細(xì)胞密度隨氮濃度的增加而增加，說明無機(jī)氮濃度的升高有利于細(xì)胞分裂；同時，磷濃度越低，小新月菱形藻的比生長速率越低。梁晶晶等[32]研究了氮、磷、鐵對三角褐指藻誘變株MP-2生長、總脂及脂肪酸的影響，結(jié)果表明該誘變株生長最適氮濃度為20 mg·L-1，當(dāng)?shù)獫舛葹?0 mg·L-1時，總脂積累量最高；生長最適磷濃度為2.5 mg·L-1，當(dāng)磷濃度為1.0 mg·L-1時總脂積累量最高。然而，對于不同氮、磷營養(yǎng)鹽條件下巖藻黃素的積累研究仍較少。本研究擬在f/2培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究不同的氮、磷營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素積累的影響，通過HPLC定量檢測巖藻黃素含量，探討氮、磷營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長的影響，以優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高巖藻黃素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗所需威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)購于上海光語生物科技有限公司；采用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)，待用。

1.1.2 實驗試劑

無水乙醇、甲醇、丙酮等試劑為國藥分析純；色譜級乙腈、色譜級甲醇購于德國默克公司；巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品為液相色譜級。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)(松原華興LGJ-12)、超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)KQ5200E)、分析天平(奧豪斯CP114)、高速離心機(jī)(艾本德5424R)、臺式高速離心機(jī)(賽默飛世爾)、渦旋儀(塞維爾生物MV-100)、自動細(xì)胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物有限公司)、高效液相色譜(美國Waters e2695)等。

1.2 方法

1.2.1 氮營養(yǎng)鹽條件設(shè)計

配制f/2缺氮培養(yǎng)基，選用硝酸鈉、硫酸銨、尿素作為氮營養(yǎng)鹽，根據(jù)f/2培養(yǎng)基配方及參考梁晶晶等[32]對三角褐指藻的生長研究，設(shè)置氮的濃度為0、0.882、1.323、1.764、2.205 mmol·L-1，每種處理設(shè)3個平行，以正常f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)的藻作為對照。培養(yǎng)條件：23℃，75 μmol·m-2·s-1，全天光照，每天手搖2～3次。

1.2.2 磷營養(yǎng)鹽條件設(shè)計

上述優(yōu)化的氮營養(yǎng)鹽配制f/2缺磷培養(yǎng)基，選用磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀作為磷營養(yǎng)鹽，磷的濃度設(shè)置為0.018、0.036、0.054、0.072 mmol·L-1，每種處理設(shè)3個平行，以正常f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)的藻作為對照。培養(yǎng)條件：23℃，75 μmol·m-2·s-1，全天光照，每天手搖2～3次。

1.2.3 威氏海鏈藻細(xì)胞密度曲線的建立

接種后，每日于超凈臺定時取樣，盧戈氏碘液固定后，通過自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，并繪制細(xì)胞密度曲線。

1.2.4 威氏海鏈藻生物量測定

待生長至穩(wěn)定后期，藻液8 000 r/min離心5 min，蒸餾水洗滌2～3次以除去海水中的鹽離子，于-20℃冰箱中放置3 h后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中預(yù)冷。從-80℃冰箱中取出，置于真空冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥40 h。結(jié)束后用分析天平稱重，計算可得威氏海鏈藻生物量(dw)=干燥后總重量(m2)-離心管重量(m1)。

1.2.5 威氏海鏈藻巖藻黃素的提取與檢測

在無光/弱光環(huán)境中，加入100 mL/g干重4℃預(yù)冷的混合溶液(丙酮∶甲醇=1∶1)，渦旋震蕩20～30 s混勻后，置于4℃冰箱避光浸提45 min。取出后10 000 r/min離心5 min，此時離心管中的上清液即為巖藻黃素粗提液。通過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，裝入2 mL棕色樣品瓶中。使用高效液相色譜儀Waters e2695對樣品進(jìn)行檢測，得到每個樣品中巖藻黃素的含量(μg·mL-1)。

1.2.6 巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以色譜級甲醇為溶劑，溶解巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品，分別配置濃度為1、5、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1的巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)液，HPLC檢測后根據(jù)濃度和峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

HPLC對不同濃度梯度的巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，根據(jù)濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。其回歸方程為Y=6.88×104X+3.21×104，R2=0.998 5。從圖1可知，巖藻黃素濃度在5～100 μg·mL-1時具有良好的線性關(guān)系。后續(xù)根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品中巖藻黃素含量(mg·g-1)及總量(mg·L-1)的計算。

2.2 氮營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

2.2.1 不同濃度硝酸鈉對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

不同濃度的硝酸鈉對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響如圖2所示。添加了硝酸鈉的4組威氏海鏈藻在接種后的第6天，細(xì)胞密度基本上都達(dá)到最高值；而缺氮組在第4天就達(dá)到最高值，且遠(yuǎn)低于其他4組(圖2A)。當(dāng)硝酸鈉濃度為1.764 mmol·L-1時，生物量最高，但與其他3組添加了硝酸鈉的相比，無顯著性差異(P>0.05)(圖2B)。當(dāng)硝酸鈉濃度分別為0.882、1.764 mmol·L-1時，每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素的含量較高，兩組之間無顯著性差異(P>0.05)，但含量最高組(硝酸鈉濃度1.764 mmol·L-1)與其他2組(硝酸鈉濃度分別為1.323、2.205 mmol·L-1)相比，存在顯著性差異(P<0.05)(圖2C)。當(dāng)硝酸鈉濃度為1.764 mmol·L-1時，每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素的總量較高，與其他4組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖2D)。在不添加硝酸鈉時，威氏海鏈藻生物量、巖藻黃素含量及總量均與其他4組存在顯著性差異，威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素積累受到明顯影響(圖2)。

2.2.2 不同濃度硫酸銨對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

以正常f/2培養(yǎng)基(硝酸鈉濃度0.882 mmol·L-1)為對照，不同濃度硫酸銨對威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素含量的影響如圖3所示。不同硫酸銨濃度培養(yǎng)的威氏海鏈藻基本上均在接種后的第6天，細(xì)胞密度達(dá)到最高值；當(dāng)硫酸銨濃度為0.441 mmol·L-1時，威氏海鏈藻細(xì)胞密度較大，且高于對照組，較低濃度的硫酸銨有助于威氏海鏈藻細(xì)胞密度的增長(圖3A)。當(dāng)硫酸銨濃度為0.441 mmol·L-1時，生物量最高，與較高濃度硫酸銨處理(硫酸銨濃度分別為0.882、1.103 mmol·L-1)及對照組相比，存在顯著性差異(P<0.05)(圖3B)。當(dāng)硫酸銨濃度分別為0.441、0.662 mmol·L-1時，每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素的含量較高，兩組之間無顯著性差異(P>0.05)，但與最高濃度處理組(硫酸銨濃度為1.103 mmol·L-1)相比，存在顯著性差異(P<0.05)(圖3C)。當(dāng)硫酸銨濃度為0.441 mmol·L-1時，每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素的總量較高，與高濃度處理組(硫酸銨濃度為0.882、1.103 mmol·L-1)相比，存在顯著性差異(P<0.05)(圖3D)。由圖3可以看出，與對照組相比，以硫酸銨作為氮營養(yǎng)鹽培養(yǎng)威氏海鏈藻，低濃度的硫酸銨有利于威氏海鏈藻生長及巖藻黃素積累，而在不添加硫酸銨時，威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素積累則受到明顯影響。

2.2.3 不同濃度尿素對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

以正常f/2培養(yǎng)基(硝酸鈉濃度0.882 mmol·L-1)為對照，不同濃度尿素對威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素含量的影響如圖4所示。不同尿素濃度培養(yǎng)的威氏海鏈藻基本上均在接種后的第6天，細(xì)胞密度達(dá)到最高值；不同濃度尿素對威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響不明顯。當(dāng)尿素濃度為0.882 mmol·L-1時，細(xì)胞密度較大(圖4A)；生物量最高，與尿素濃度為0.662、1.103 mmol·L-1的實驗組及對照組相比，存在顯著性差異(P<0.05)(圖4B)；每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素含量較高，與其他組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖4C)；每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素總量較高，與其他組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖4D)。由圖4可以看出，與對照組相比，以尿素作為氮營養(yǎng)鹽培養(yǎng)威氏海鏈藻，濃度為0.882 mmol·L-1的尿素明顯有利于威氏海鏈藻生長及巖藻黃素積累，在不添加氮營養(yǎng)鹽時，威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素積累受到明顯影響。

2.2.4 三種最佳濃度的氮營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量影響的比較

根據(jù)前述比較，選取三種最佳濃度的氮營養(yǎng)鹽進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖5所示。不同最佳濃度的氮營養(yǎng)鹽培養(yǎng)的威氏海鏈藻基本上均在接種后的第6天，細(xì)胞密度達(dá)到最高值；其中在硫酸銨濃度為0.441 mmol·L-1時，威氏海鏈藻細(xì)胞密度最高(圖5A)。在0.882 mmol·L-1尿素處理下，生物量最高，與對照組相比存在顯著性差異(P<0.05)(圖5B)；每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素含量最高，與其他2組及對照組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖5C)；每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素總量最高，與其他2組及對照組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖5D)。由圖5可以看出，以0.882 mmol·L-1尿素為氮營養(yǎng)鹽，有利于威氏海鏈藻的生長及巖藻黃素積累。在0.441 mmol·L-1硫酸銨處理下，細(xì)胞密度最大，但在0.882 mmol·L-1尿素處理下，生物量最大，結(jié)合巖藻黃素含量結(jié)果，分析可能的原因為在0.441 mmol·L-1硫酸銨處理下的威氏海鏈藻生長速度較快，但油脂等代謝產(chǎn)物較少，細(xì)胞個體較小，導(dǎo)致生物量較低。

2.3 磷營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

2.3.1 不同濃度磷酸二氫鈉對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

不同濃度磷酸二氫鈉對威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素含量的影響如圖6所示。添加了磷酸二氫鈉的4組和對照組在接種后的第6、7天，威氏海鏈藻的細(xì)胞密度達(dá)到最高值，而缺磷組則在第5天就達(dá)到最高值，且遠(yuǎn)低于其他5組，較高濃度的磷酸二氫鈉有助于威氏海鏈藻細(xì)胞密度的增長(圖6A)。不同濃度磷酸二氫鈉對生物量的影響不明顯，不存在顯著性差異(P>0.05)(圖6B)。不同濃度磷酸二氫鈉對每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素含量及每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素總量的影響均不明顯，不存在顯著性差異(P>0.05)(圖6C、圖6D)。由圖6可以看出，磷酸二氫鈉對威氏海鏈藻生長及巖藻黃素積累無明顯影響。

2.3.2 不同濃度磷酸二氫鉀對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量的影響

不同濃度磷酸二氫鉀對威氏海鏈藻的生長和巖藻黃素含量的影響如圖7所示。添加了磷酸二氫鉀的4組和對照組在接種后的第5、6天，威氏海鏈藻的細(xì)胞密度達(dá)到最高值，較低濃度的磷酸二氫鉀(濃度為0.018 mmol·L-1)不利于威氏海鏈藻細(xì)胞密度的增長(圖7A)。不同濃度磷酸二氫鉀對生物量的影響不明顯，不存在顯著性差異(P>0.05)(圖7B)。當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為0.054 mmol·L-1時，每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素含量較高，與其他組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖7C)。當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為0.054 mmol·L-1時，每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素總量較高，與其他組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖7D)。由圖7可以看出，0.054 mmol·L-1磷酸二氫鉀有利于巖藻黃素的積累。

2.3.3 兩種最佳濃度磷營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長和巖藻黃素含量影響的比較

根據(jù)前述比較結(jié)果，選取兩種最佳濃度的磷營養(yǎng)鹽進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖8所示。不同最佳濃度的磷營養(yǎng)鹽培養(yǎng)的威氏海鏈藻基本上均在接種后的第6、7天，細(xì)胞密度達(dá)到最高值(圖8A)。在0.054 mmol·L-1磷酸二氫鈉處理下，生物量最高，與磷酸二氫鉀組相比，存在顯著性差異(P<0.05)(圖8B)。在0.054 mmol·L-1磷酸二氫鉀處理下，每g干重威氏海鏈藻中巖藻黃素含量最高，與其他組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖8C)；每L威氏海鏈藻藻液中巖藻黃素總量最高，與其他組相比，均存在顯著性差異(P<0.05)(圖8D)。由圖8可以看出，從細(xì)胞密度和生物量來看，以0.054 mmol·L-1磷酸二氫鈉為磷營養(yǎng)鹽，有利于威氏海鏈藻的生長，但0.054 mmol·L-1磷酸二氫鉀更有利于巖藻黃素的積累。

3 討論與結(jié)論

本研究主要通過改變培養(yǎng)基中氮、磷營養(yǎng)鹽濃度，比較其對威氏海鏈藻生長及巖藻黃素積累的影響。氮是威氏海鏈藻生長發(fā)育的重要生態(tài)因子，藻細(xì)胞能夠?qū)Σ煌螒B(tài)的氮營養(yǎng)鹽進(jìn)行選擇性吸收和利用。徐興蓮等[33]研究發(fā)現(xiàn)，氮限制抑制了三角褐指藻的生長與光合活性，其葉綠素a含量降低，PSⅡ光反應(yīng)中心部分關(guān)閉。不同藻類對氮營養(yǎng)鹽的利用存在差異，張青田等[34]研究了相同濃度下氯化銨和尿素對幾種藻類生長的影響，發(fā)現(xiàn)氯化銨作為氮營養(yǎng)鹽更有利于赤潮異彎藻、纖細(xì)角毛藻和亞歷山大藻的生長，而尿素更有利于隱藻的生長。朱明等[35]研究表明，與硝酸鹽相比，氨鹽作為氮營養(yǎng)鹽更有利于威氏海鏈藻的生長代謝，這是因為微藻對于氨鹽的吸收引起培養(yǎng)基pH值的下降，對因光合作用導(dǎo)致的培養(yǎng)液pH值上升起到緩沖作用，而有利于微藻生長。本研究中，在相同氮濃度(0.441 mmol·L-1硫酸銨和 0.882mmol·L-1硝酸鈉)培養(yǎng)下，硫酸銨更有利于威氏海鏈藻的生長與巖藻黃素的積累。竇勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與無機(jī)氮營養(yǎng)鹽相比，尿素更有利于提高威氏海鏈藻細(xì)胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度，本研究中，0.882 mmol·L-1的尿素最適合威氏海鏈藻的生長及巖藻黃素的積累。另外，也有許多學(xué)者研究了氮磷比對威氏海鏈藻生長的影響，在相同氮磷比條件下，提高氮磷營養(yǎng)鹽濃度有利于威氏海鏈藻的生長與光合作用[5]；同時，劉皓等[36]研究發(fā)現(xiàn)，相比于磷營養(yǎng)鹽，氮營養(yǎng)鹽濃度對威氏海鏈藻的生長影響較大。本研究中，與磷營養(yǎng)鹽相比，氮營養(yǎng)鹽濃度對威氏海鏈藻生長及巖藻黃素積累影響較大，生物量增長與巖藻黃素積累量增加均更為明顯，與前述研究結(jié)果基本一致。

本研究選取了硝酸鈉、硫酸銨與尿素為氮營養(yǎng)鹽，磷酸二氫鈉與磷酸二氫鉀為磷營養(yǎng)鹽，分別設(shè)置了4個濃度梯度，實驗結(jié)果表明：1)0.882 mmol·L-1尿素明顯有利于威氏海鏈藻的生長及巖藻黃素的積累，與其他氮營養(yǎng)鹽相比，存在顯著性差異(P<0.05)；生物量、巖藻黃素含量和巖藻黃素總量最高分別可達(dá)到 0.203 g·L-1、21.806 mg·g-1和4.449 mg·L-1，與對照組相比，生物量提高了45.4%，巖藻黃素含量提高了66.5%，巖藻黃素總量提高了173.1%。2)以上述優(yōu)化的氮營養(yǎng)鹽為基礎(chǔ)，比較磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀兩種磷鹽對威氏海鏈藻生長及巖藻黃素積累的影響，發(fā)現(xiàn)0.054 mmol·L-1磷酸二氫鉀在威氏海鏈藻生物量的積累上無顯著性差異(P>0.05)，但在巖藻黃素含量積累方面，與其他磷營養(yǎng)鹽相比，存在顯著差異(P<0.05)。與對照組相比，巖藻黃素含量提高了78.9%，巖藻黃素總量提高了92.1%。在缺氮、缺磷的條件下，威氏海鏈藻的生長及巖藻黃素的積累均受到嚴(yán)重影響。

本次實驗研究了氮、磷營養(yǎng)鹽對威氏海鏈藻生長的影響，在f/2培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上設(shè)置了不同的氮、磷營養(yǎng)鹽及不同的濃度，為培養(yǎng)基優(yōu)化及提高威氏海鏈藻巖藻黃素產(chǎn)量提供了理論基礎(chǔ)。