霍寧寧， 李研東， 霍惠玲， 韓 雪*， 苗玉濤

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省獸藥飼料工作總站，河北石家莊 050035）

近些年，由“獸藥殘留”引發(fā)的食品安全問題和“耐藥性傳遞”引發(fā)的生物安全問題備受關(guān)注。政府部門密集出臺(tái)多項(xiàng)政策嚴(yán)控養(yǎng)殖投入品的規(guī)范使用。2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告的（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告，2019）頒布實(shí)施，標(biāo)志著我國飼料行業(yè)正式步入“無抗時(shí)代”。在減抗大形勢(shì)下，飼料中非法添加獸藥（允許添加的品種除外）的情況仍屢屢發(fā)生。針對(duì)飼料中非法添加獸用藥物進(jìn)行監(jiān)管是新政策出臺(tái)后相關(guān)政府部門所面臨的新挑戰(zhàn)。

現(xiàn)有的獸藥殘留檢測方法多是針對(duì)單一品種的已知目標(biāo)物進(jìn)行定量或定性分析，諸如中藥材、動(dòng)物尿液、獸藥殘留和食品中（王聰?shù)龋?021；李岳等，2019；蘇燕，2019；賀美蓮等，2018；潘晨松，2018；孫雷等，2017）未知物篩查的分析報(bào)道較多，而針對(duì)高通量的、可同時(shí)檢測上百種未知物的篩查方法很少，對(duì)基質(zhì)更加復(fù)雜的預(yù)混合飼料中未知藥物篩查的研究和標(biāo)準(zhǔn)則更少。本文采用超高效液相色譜四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜進(jìn)行檢測，建立小分子篩查數(shù)據(jù)庫，結(jié)合TraceFinder篩查軟件分析，旨在通過建立適用于復(fù)合預(yù)混合飼料中未知藥物的高通量快速篩查方法，為進(jìn)一步優(yōu)化完善飼料高通量檢驗(yàn)方法，拓展更多獸用藥物和非法添加物的篩查途徑提供數(shù)據(jù)支撐，為政府部門的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供便捷而準(zhǔn)確的技術(shù)路徑，更好的為企業(yè)諸如原材料質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)控制、成品監(jiān)督及相關(guān)檢驗(yàn)需求提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑157種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)irst Standard，阿爾塔公司；乙腈（色譜純），默克；蒸餾水，屈臣氏；甲酸，賽默飛世爾科技公司。

1.2儀器與設(shè)備UltiMate 3000-Q-Exactive Focus，色譜柱Accucore RP-MS，Thermo公司。

1.3 試樣溶液制備 稱取復(fù)合預(yù)混合飼料樣品2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 50%乙腈水溶液，渦旋混勻3 min，超聲提取30 min。12000 r/min離心10 min；取上清液1 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，供質(zhì)譜分析用。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：Accucore RP-MS柱（100 mm×2.1 mm，粒徑2.6 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：0.05%甲酸水，流動(dòng)相B：0.05%甲酸乙腈；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI源），正負(fù)離子檢測模式（ESI+、ESI-）同時(shí)掃描，掃描方式為一級(jí)全掃描/數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)質(zhì)譜掃描（FUll MS/dd-MS2），源區(qū)主要參數(shù)設(shè)置：鞘氣流速為9 arb，噴霧電壓為3 kV，毛細(xì)管（離子傳輸管）溫度320℃，S-lens電壓55 kV，輔助氣加熱溫度30℃。質(zhì)譜一級(jí)掃描模式為Full MS模式，掃描范圍（m/z）100~900，一級(jí)分辨率70000，進(jìn)入C-Trap的離子數(shù)目1e6，離子最大注入時(shí)間100 ms；二級(jí)掃描模式模式dd MS2，二級(jí)分辨率35000，頂點(diǎn)激發(fā)時(shí)間3~6 s，設(shè)置階梯碰撞能20、35、50 kV，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間8 s。采集數(shù)據(jù)前使用正負(fù)離子校正液進(jìn)行質(zhì)量軸校正。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)通過Xcalibur軟件提取化合物碎片離子信息，通過TraceFinder建立篩查數(shù)據(jù)庫。篩查數(shù)據(jù)庫信息見表2。

表2 篩查數(shù)據(jù)庫信息

1.6 篩查結(jié)果判定 根據(jù)歐盟2002/657/EC準(zhǔn)則（EU.Commission Decision，2002），應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析時(shí)，篩查規(guī)則中提出，有1個(gè)母離子和1個(gè)子離子、或2個(gè)子離子匹配則確證分析的樣品含有該化合物（侯粲，2016）。對(duì)于疑似陽性樣品，進(jìn)一步在ddMS2模式下對(duì)其進(jìn)行二級(jí)特征碎片離子掃描，當(dāng)有2個(gè)或以上豐度較高的碎片離子與標(biāo)準(zhǔn)譜圖中相應(yīng)的碎片離子精確質(zhì)量數(shù)偏差小于105，且碎片離子的相對(duì)豐度比在最大允許偏差范圍內(nèi)時(shí)，確證含有該化合物（侯粲，2016）。

對(duì)供試品溶液進(jìn)行Full MS/ddMS2全掃描，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)篩查數(shù)據(jù)庫中的m/z精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行篩查。當(dāng)未知物保留時(shí)間在±0.5 min且母離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差在105、5 ppm范圍內(nèi)，子離子精確質(zhì)量數(shù)在104、5 ppm范圍內(nèi)，同位素豐度比在70%范圍內(nèi)，檢測結(jié)果為疑似陽性樣品，否則判定為陰性樣品。

2 結(jié)果

2.1 空白樣品和添加陽性樣品篩查結(jié)果 在對(duì)空白添加樣品進(jìn)行快速篩查時(shí)，藥物濃度50 ng/g時(shí)檢出率為98.7%，添加藥物濃度100 ng/g時(shí)藥物檢出率為100%，該方法可基本滿足預(yù)混合飼料中非法使用獸藥的高通量快速檢測。根據(jù)實(shí)際樣品檢測結(jié)果，空白樣品基質(zhì)中有部分物質(zhì)響應(yīng)低（e3、e4），且出峰時(shí)間與添加陽性樣品中的物質(zhì)不對(duì)應(yīng)，判斷為樣品中基質(zhì)出峰。應(yīng)用該方法處理樣品采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，能夠應(yīng)用于各種預(yù)混合飼料樣品中非法添加未知藥物的篩查工作，其正確率較高?？瞻讟悠凡糠治镔|(zhì)圖譜與添加陽性樣品圖譜見圖1和2。

圖1 空白樣品部分物質(zhì)色譜圖

2.2 篩查未知物二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 在全掃描模式下，對(duì)HRMS參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得了高分辨率、高靈敏度的二級(jí)結(jié)構(gòu)碎片離子（Suo等，2022）。該數(shù)據(jù)庫所包含的藥物大部分在ESI+電離模式下的響應(yīng)值最大，容易獲得H離子并形成[M+H]+；幾種物質(zhì)在ESI-電離模式下的響應(yīng)值最大，容易失去H離子并形成[M-H]-。在全掃描dd MS2條件下，毛細(xì)管電壓和特征碎片離子參數(shù)完全優(yōu)化，NCE值分別為20、35和50。通過Xcalibur軟件中的分子擬合初步得到碎片離子的精確分子質(zhì)量和分子式，計(jì)算母離子與碎片質(zhì)量（M/Z）之差，判斷物質(zhì)脫落的部分結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測碎片的分子結(jié)構(gòu)。如圖3，選取部分代表性物質(zhì)分析預(yù)測碎片離子結(jié)構(gòu)。母離子質(zhì)核比220.1443降低60 Da得到160.0869［M+H-60]+碎片離子，且該分子結(jié)構(gòu)易脫落-1-羥基-2-異丙基氨基乙基部分結(jié)構(gòu)，又知該分子式少了-C3H8O，故結(jié)構(gòu)式如圖中所示；根據(jù)202.13383［M+H-18]+碎片離子的分子式相較于母體結(jié)構(gòu)少了-H2O，故可推測該碎片離子結(jié)構(gòu)式如圖中所示。母離子質(zhì)核比256.0880降低100 Da得到156.01141［M+H-100]+碎片離子，該物質(zhì)磺胺?；系臍?，可被不同雜環(huán)取代，又知分子式少了-C3H4N2S，故判斷該碎片的結(jié)構(gòu)式如圖中所示；108.04484［M+H-148]+碎片離子降低148 Da，結(jié)合分子式可知結(jié)構(gòu)為磺胺酰基。同理分析得到8種代表性物質(zhì)分析預(yù)測碎片離子結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 8種代表性物質(zhì)分析預(yù)測碎片離子結(jié)構(gòu)

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

3 討論

本文結(jié)合高分辨質(zhì)譜的分辨率高、可準(zhǔn)確定性、檢測通量高的優(yōu)勢(shì)（李濤等，2017），建立了一種可應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)飼料中非法添加物高通量篩查的快速、準(zhǔn)確的定性檢驗(yàn)方法。通過前處理后的樣品進(jìn)行上機(jī)檢測，可快速鎖定待測樣品中非法添加物的種類，進(jìn)而結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確的含量信息，對(duì)其進(jìn)行定量，達(dá)到飼料中非法添加物的定量信息。

本文選擇基質(zhì)物質(zhì)相對(duì)復(fù)雜的預(yù)混合飼料作為空白樣本，旨在測試在復(fù)雜基質(zhì)干擾下本方法的抗基質(zhì)干擾能力。按照復(fù)合預(yù)混合飼料標(biāo)簽內(nèi)容，該樣品中含多種維生素、微量元素和氨基酸，基質(zhì)相對(duì)配合飼料、濃縮料等產(chǎn)品復(fù)雜多樣，對(duì)樣品前處理要求更高。本方法在滿足不影響檢驗(yàn)效率的情況下，盡量簡化前處理程序，以實(shí)現(xiàn)快速檢驗(yàn)的目的，因此該方法可適用于預(yù)混合飼料、配合飼料、濃縮料、精料補(bǔ)充料和大多數(shù)常規(guī)的混合型飼料添加劑。單一飼料、飼料添加劑因其使用范圍的局限性，通常為達(dá)到某種目的而使用某些特定品種或特定用途的藥物，沒有進(jìn)行高通量非法篩查的必要，應(yīng)作特定種類的藥物定性定量檢測。

對(duì)于藥物的檢出限和檢出率，當(dāng)157種藥物添加濃度為50 ng/g時(shí)，檢出155種，檢出率為98.7%；當(dāng)藥物添加濃度為100 ng/g時(shí)，157種藥物全部檢出，檢出率為100%。在飼料中主觀添加非法藥物發(fā)揮抗病或治療效果，按照藥物飼料添加劑使用規(guī)程和獸醫(yī)治療用藥規(guī)程，其添加濃度不會(huì)低于此濃度；生產(chǎn)過程因不可控因素所帶入的藥物污染低于100 ng/g時(shí)，在機(jī)體內(nèi)殘留所產(chǎn)生的影響可以忽略，因此本文所選擇的檢測濃度已滿足實(shí)際檢測的需要。

目前，篩查方法基于檢驗(yàn)的非法添加物篩查數(shù)據(jù)庫仍在進(jìn)一步擴(kuò)充，數(shù)據(jù)庫藥物種類和數(shù)量會(huì)陸續(xù)增加和完善，前處理方法也會(huì)因藥物種類的增加而進(jìn)一步優(yōu)化，拓寬基質(zhì)考察范圍，優(yōu)化前處理?xiàng)l件，開發(fā)兼容性更強(qiáng)、更高通量的前處理方法（郭添榮，2021）是未來發(fā)展的方向。某些特殊藥物、特殊基質(zhì)的樣品會(huì)在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步開發(fā)和增加，提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度和精確度也是需要考慮的，以更加充分發(fā)揮高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)。