許麗麗 綜述，陳 婷，黃文輝 審校

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是成人中最常見的單基因遺傳性腎病。據(jù)2020年中國ADPKD臨床實踐指南報道，ADPKD患病率為1/2 500～1/1 000，中國有125萬例患者，大約一半的患者在60歲時進(jìn)展為終末期腎病,被認(rèn)為是終末期腎病的第四大原因[1-2]。主要表現(xiàn)為雙側(cè)腎囊腫進(jìn)行性發(fā)展和擴(kuò)大，并伴有腎小球濾過率降低、高血壓、肝囊腫、腦動脈瘤等[3]。迄今為止，ADPKD的治療主要包括拮抗血管加壓素受體(托伐普坦)、支持措施(控制血壓、增加液體攝入量、限鹽和戒煙)及必要時腎臟替代治療等[4]，尚缺乏特異性治療藥物。近年來，越來越多的微小RNA(miRNA)被發(fā)現(xiàn)在包括多囊腎(PKD)在內(nèi)的腎臟發(fā)育中存在差異表達(dá)，可通過影響關(guān)鍵生長因子或相關(guān)信號通路參與腎臟發(fā)育過程[5]。因此，研究miRNA在ADPKD發(fā)病中的作用對ADPKD生物標(biāo)志物的確定及治療靶點的選擇具有重要意義?，F(xiàn)將目前已知的miRNA與ADPKD的關(guān)系綜述如下。

1 ADPKD發(fā)病機(jī)制

目前，ADPKD發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制有纖毛致病假說、螺旋區(qū)-螺旋區(qū)相互作用假說、“二次打擊”假說等，最近有研究表明，表觀遺傳學(xué)(組蛋白修飾、DNA甲基化及翻譯后修飾)改變同樣可促進(jìn)ADPKD的發(fā)生、發(fā)展。ADPKD發(fā)病機(jī)制：(1)ADPKD主要由編碼多囊蛋白1(PC1)和PC2的PKD1(16p13.3)和PDK2(4q21)基因突變所致，PKD1是一種多結(jié)構(gòu)域糖蛋白并在G蛋白偶聯(lián)受體蛋白水解位點被剪切，PKD2屬陽離子鈣調(diào)節(jié)通道的瞬時受體電位家族的一種蛋白，80%的患者通過突變的PKD1和15%的患者通過突變的PKD2基因發(fā)展為ADPKD，其余5%的發(fā)病機(jī)制可能涉及其他基因的突變[6]。(2)纖毛致病假說。有研究表明，腎纖毛由腎小管上皮細(xì)胞深入腎小管腔，與尿液直接接觸，主要功能是作為機(jī)械感受尿流刺激，PC1、PC2均位于初級纖毛(一種在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用的頂端觸角狀細(xì)胞器)上并形成多囊蛋白復(fù)合體，將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號傳遞給細(xì)胞,二者中任意一種缺失均會使初級纖毛功能異常，造成細(xì)胞內(nèi)鈣和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的變化，以及隨后的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Wnt等信號通路改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和液體分泌異常，囊腫形成和生長[7]。(3)螺旋區(qū)-螺旋區(qū)相互作用假說。PC1、PC2借助C端螺旋區(qū)相互作用,成為ADPKD發(fā)病的共同途徑，并且PC1的穩(wěn)定表達(dá)可能依賴于PC2的存在[8]。(4)“二次打擊”假說。囊腫始于正常腎小管，PKD1或PKD2的生殖系突變導(dǎo)致一個等位基因的丟失，而體細(xì)胞的第2次打擊導(dǎo)致另一個正常等位基因的丟失，隨后腎毒性損傷和(或)缺血在內(nèi)的一個或多個途徑導(dǎo)致囊腫發(fā)生作為“第3次打擊”，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞增殖，引起擴(kuò)張及形成大小不等的充滿液體的囊腫[9]。(5)表觀遺傳學(xué)。表觀遺傳調(diào)控有2種主要形式：①組蛋白乙?；?，組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是PKD基因的調(diào)節(jié)因子和(或)參與囊腫發(fā)生的信號通路，在腎上皮細(xì)胞中HDAC5已被確定為PKD1依賴的液體壓力感應(yīng)的靶點，PKD1蛋白產(chǎn)物多囊素促進(jìn)鈣離子流入細(xì)胞，并促進(jìn)HDAC5蛋白激酶C磷酸化[10]，HDAC6在PKD1突變小鼠腎細(xì)胞中上調(diào)，抑制HDAC6通過降低細(xì)胞內(nèi)cAMP和Ca2+水平抑制囊腫細(xì)胞生成[11]；②DNA甲基化，2014年WOO等[12]報道了ADPKD患者樣本DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)基因組中有13 000多個不同甲基化片段，91%為高甲基化的，基因組外顯子區(qū)是ADPKD DNA甲基化變化的主要靶點，高甲基化促進(jìn)囊腫的發(fā)生。進(jìn)一步研究表明，ADPKD患者整個組織中生成的差異甲基化片段主要反映在單個ADPKD囊腫的甲基化組中[13]；③翻譯后修飾，miRNA翻譯后修飾可改變基因表達(dá)的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制，與ADPKD的關(guān)系將在后文介紹。除上述之外，還提出了鈣信號通路缺陷、終止信號假說、齊-雜合子學(xué)說等。另外，囊腫形成和擴(kuò)張本身伴隨著炎癥、巨噬細(xì)胞活化、缺血、細(xì)胞因子產(chǎn)生和腎小管阻塞等，這些可能進(jìn)一步促進(jìn)了囊腫形成和生長的環(huán)境，即所謂的“滾雪球”效應(yīng)[14]。迄今為止，ADPKD很多發(fā)病機(jī)制尚未明了，仍需通過進(jìn)一步研究發(fā)掘。

2 miRNA的發(fā)現(xiàn)、形成及功能

miRNA是一類內(nèi)源性小非編碼 RNA (19～25個核苷酸)，具有保守性、組織特異性和時序性,調(diào)控包括發(fā)育時間、造血、臟器發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖，甚至可能是腫瘤發(fā)生等多種途徑[15]。1993年第1個miRNA在秀麗新小桿線蟲體內(nèi)中被發(fā)現(xiàn)[16]，迄今為止，約2 300個人類成熟miRNA被報道，其中1 115個在miRNA數(shù)據(jù)庫被標(biāo)注[17]，在健康或疾病狀態(tài)下幾乎所有生物途徑均受到miRNA的調(diào)控。miRNA的形成大致包括以下步驟：(1)大部分miRNA基因在細(xì)胞核中被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成長鏈初級miRNA(pri-miRs)；(2)Pri-miRs被核糖核酸酶Ⅲ型核酸內(nèi)切酶及雙鏈RNA結(jié)合蛋白處理形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Pri-miRs；(3) Pri-miRs被輸出蛋白5轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì),被另一種核糖核酸酶Ⅲ型核酸酶處理成為成熟雙鏈RNA；(4)雙鏈miRs分子中的引導(dǎo)鏈被選擇性加載到AGO中形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，而另一條過客鏈從AGO中釋放并被降解；(5)miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物根據(jù)miRNA引導(dǎo)鏈的種子序列，對靶miRNA進(jìn)行翻譯抑制或降解，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[18]。miRNA是體內(nèi)平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其失調(diào)是引起ADPKD在內(nèi)的多種疾病的基礎(chǔ),因此，miRNA可能是ADPKD有前途的診斷生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點。

3 miRNA在ADPKD中的作用機(jī)制

3.1miR-17～92與ADPKD miR-17～92是一種進(jìn)化上保守的多順反子miRNA簇，是最具特征的miRNA癌基因之一，主要位于人類基因組C13orf25的800堿基對區(qū)域，由非蛋白編碼基因MIR17HG編碼的7 kb轉(zhuǎn)錄本生成；根據(jù)種子序列同源性，miR-17～92可分為4個家族，即miR-17 (miR-17-5p和miR-20a)、miR-18、miR19(miR-19a和19b-1)和miR-92 (miR-92-1)，還包括2個旁系同源簇，即miR-106b～25和miR106a～363)[19]。miR-17～92具有促進(jìn)增殖、逃避凋亡反應(yīng)，以及抑制分化、增加血管生成和維持細(xì)胞存活等功能[20]，與ADPKD的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明，miR-17～92在Kif3a-KO小鼠、Pkhd1-/-小鼠、Pkhd1/cre；Pkd2F/F等多個PKD小鼠模型表達(dá)上調(diào)，并在miR-17～92過表達(dá)小鼠腎臟中觀察到腎小管擴(kuò)張、腎小管囊腫和腎小球囊腫，這些效應(yīng)可能與miR-17～92通過促進(jìn)增殖、PKD基因(PKD1、PDK2)和肝細(xì)胞核因子-1β的轉(zhuǎn)錄后抑制來介導(dǎo)，因此，特異性失活miR-17～92可抑制囊腫的生長，改善腎功能，延長生存期[21]。通過抑制miR-17～92可能是ADPKD的一種有效的治療方法。 MiR-17是miR-17～92中的一種促增殖miRNA，目前已在真核生物中得到廣泛研究，被認(rèn)為是ADPKD的一個有價值的藥物靶點。有研究表明，在PKD1、PKD2敲除的小鼠模型和ADPKD患者腎囊腫樣本中miR-17表達(dá)上調(diào)，且 PKD2的 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)比PKD1更具保守性；在HEK293細(xì)胞中miR-17可直接靶向作用于PKD2的3′UTR，通過轉(zhuǎn)錄后抑制PKD2基因表達(dá)，促進(jìn)囊腫細(xì)胞增殖[22]。HAJARNIS等[23]研究表明，miR-17基因缺失會抑制囊腫增殖和PKD進(jìn)展，其原因可能是改善了線粒體功能，在ADPKD小鼠模型中miR-17可被原癌基因cMyc靶向激活，直接作用于過氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα)抑制氧化磷酸化和脂肪酸氧化基因表達(dá)，最終調(diào)節(jié)線粒體代謝，促進(jìn)ADPKD發(fā)展；抗miR-17及PPARγ激動劑可抑制PKD小鼠模型的囊腫生長，說明由cMyc-miR-17-PPARα信號軸誘導(dǎo)的促增殖代謝途徑是ADPKD發(fā)病機(jī)制之一。目前，RGLS4326是一種miR-17短寡核苷酸抑制劑，已被證實可通過抑制miR-17的PKD1、PKD2等多個靶點以減弱囊腫生長，并在體外ADPKD模型和多個PKD小鼠模型中顯示出良好的穩(wěn)定性、安全性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特點[24]。因此，miR-17及其靶點對ADPKD的治療至關(guān)重要。

3.2miR-21與ADPKD miR-21是最早被識別的miRNA之一，由位于染色體17q23.2上的液泡膜蛋白1基因編碼，進(jìn)化保守的miR-21在高細(xì)胞增殖、抗凋亡、高侵襲和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)癌細(xì)胞中高度表達(dá)，因此，miR-21也被認(rèn)為是一種致癌基因[25-26]。LAKHIA等[27]研究表明，miR-21表達(dá)上調(diào)是嚙齒動物和人類PKD的共同特征，囊腫上皮細(xì)胞是miR-21水平升高的主要來源；在ADPKD直系同源小鼠模型中cAMP可通過激活PKA促進(jìn)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)與miR-21啟動子靶向結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)PKD的發(fā)生、發(fā)展，miR-21基因缺失抑制囊腫發(fā)展。另外，程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)是miR-21的新靶點，miR-21可通過直接抑制PDCD4而抑制囊腫上皮細(xì)胞凋亡。其中CREB在腎囊腫發(fā)生過程中具有關(guān)鍵作用[28]。因此，cAMP/CREB-miR-21-PDCD4信號軸可能成為ADPKD的一個新的藥物干預(yù)途徑。一項循環(huán)miRNA作為ADPKD患者生物標(biāo)志物的研究對ADPKD患者根據(jù)慢性腎臟病(CKD)分期進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)，miR-21在內(nèi)的8個miRNAs表達(dá)水平隨腎小球濾過率下降至少增加2倍[29]，為循環(huán)miRNA預(yù)測ADPKD疾病進(jìn)展提供了理論依據(jù)，但尚需更多的研究進(jìn)一步證實。

3.3miR-132-3p 與ADPKD 氧化應(yīng)激在ADPKD發(fā)病早期發(fā)揮了核心作用,促進(jìn)囊腫的生長機(jī)制可能與一氧化氮合成不足、內(nèi)皮功能障礙和粒體功能障礙有關(guān)[30]。miR-132在小鼠、人類、蒼蠅及其他具有類似結(jié)構(gòu)和序列的物種中均具有保守性，人體內(nèi)miR-132由17號染色體上的hsa-miR132-5p和hsa-miR-132-3p組成，miR-132-3p是miR-132/212的重要組成部分，對人體不同系統(tǒng)之間的生理平衡至關(guān)重要[31]。miR-132-3p作為miR-132的剪接變體，被證明直接靶向并負(fù)向調(diào)控叉頭框O3(Foxo3)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)和凋亡[32-33]。Foxo3是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，參與了細(xì)胞代謝、細(xì)胞氧化還原、細(xì)胞增殖等過程，是已知的氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[34]。CHOI等[35]通過 PKD1選擇性基因敲除小鼠miRNA測序和ADPKD患者基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，miR-132-3p在小鼠和人類ADPKD中均顯著表達(dá)，是Foxo3a的關(guān)鍵調(diào)控因子，有趣的是，在ADPKD線粒體中甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(Gatm)基因表達(dá)被下調(diào)，miR-132-3p過表達(dá)可抑制Foxo3并降低Gatm的表達(dá)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，促進(jìn)ADPKD的囊腫生長，因此，miR-132-3p-Foxo3a-Gatm信號軸在ADPKD中的氧化應(yīng)激發(fā)揮著關(guān)鍵作用，miR-132-3p的進(jìn)一步研究對ADPKD早期診斷和防治具有重要意義。

3.4miR-182與ADPKD 肌動蛋白細(xì)胞骨架異常是ADPKD的一個顯著特征[35,37]。最近一項研究表明，ADPKD中肌動蛋白細(xì)胞骨架和囊腫的發(fā)生存在直接聯(lián)系，這是一種新的信號傳導(dǎo)機(jī)制,并受miR-182-5p的調(diào)控，miR-182-5p在野生型Pkd1f/f 模型小鼠髓質(zhì)區(qū)和腎小球中表達(dá)，并在小鼠飼養(yǎng)的第7天觀察到miR-182-5p表達(dá)于囊腫上皮細(xì)胞中；另外，在PKD1缺陷小鼠模型腎囊腫上皮細(xì)胞中肌動蛋白細(xì)胞骨架減少和紊亂，其標(biāo)記基因Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族成員2、胞質(zhì)分裂作用因子1和 整合素α4表達(dá)水平均顯著降低，miR-182-5p過表達(dá)靶向抑制肌動蛋白細(xì)胞骨架標(biāo)記物及肌動蛋白細(xì)胞骨架的組織，特別是板粒的形成，最終促進(jìn)囊腫生長[38]。因此，miR-182-5p可能通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架，成為一種新的誘導(dǎo)因子在ADPKD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SUN等[39]也發(fā)現(xiàn)，miR-182在Pkd1-/-小鼠模型中較對照組顯著增加，同時，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的ADPKD囊腫上皮細(xì)胞中Smad3 蛋白表達(dá)明顯增加；在囊腫上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-182模擬物后未受TGF-β1誘導(dǎo)的ADPKD囊狀上皮細(xì)胞miR-182表達(dá)上調(diào)，TGF-β1誘導(dǎo)的ADPKD囊腫上皮細(xì)胞中miR-182表達(dá)更高，提示miR-182通過TGF-β1/Smad3通路抑制PKD腎纖維化的分子機(jī)制。TGF-β1是纖維化過程中的一個關(guān)鍵的促纖維化生長因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡，而miR-182的表達(dá)與TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化呈正相關(guān)[40]。由此可見，miR-182在ADPKD發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。

3.5miR-214與ADPKD miR-214由一種名為Dnm3os的反義非編碼RNA編碼，最初被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，在人類腎臟疾病和動物腎臟疾病模型中高表達(dá)[41-42]。巨噬細(xì)胞可促進(jìn)囊腫的形成和發(fā)展，清除PKD小鼠腎臟中的巨噬細(xì)胞可顯著降低囊性指數(shù)及囊壁細(xì)胞增殖，并改善腎功能[43]。LAKHIA等[44]研究表明，miR-214及其宿主長非編碼RNA Dnm3os在小鼠和人ADPKD中穩(wěn)定且持續(xù)表達(dá)，囊腫微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞是miR-214主要來源；另外，miR-214具有抑制囊腫相關(guān)炎癥和致病性MRC1+巨噬細(xì)胞積聚的作用，盡管miR-214的基因缺失并不影響腎臟發(fā)育或體內(nèi)平衡，但在PKD2-和PKD1-突變小鼠中抑制miR-214會加重囊腫的生長，其機(jī)制是Toll樣受體4(TLR4)/干擾素-γ/重組人信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1促炎通路激活miR-214，反過來，miR-214作為一個負(fù)反饋環(huán)直接抑制TLR4，表明miR-214的缺失與TLR4表達(dá)增加和囊腫巨噬細(xì)胞積累增強(qiáng)相關(guān)。因此，miR-214表達(dá)水平的上調(diào)是囊腫微環(huán)境的代償性保護(hù)反應(yīng)，其功能是抑制炎癥和囊腫生長，但miR214在ADPKD中的作用尚需進(jìn)一步確定。

3.6miR501-5p與ADPKD mTOR信號通路或機(jī)制靶點參與了ADPKD囊腫的形成和擴(kuò)大過程,在許多PKD患者的16號染色體上PKD1基因和鄰近的 結(jié)節(jié)性硬化癥基因2(TSC2)基因缺失,且PKD1基因和TSC1或TSC2基因雜合突變小鼠比單基因突變小鼠出現(xiàn)更多的腎囊腫[45]。DE STEPHANIS等[46]在ADPKD細(xì)胞和組織中觀察到磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)和TSC1基因表達(dá)水平降低，mTOR磷酸化水平及miR501-5p表達(dá)水平顯著升高。PTEN和TSC1是mTOR的上游效應(yīng)分子，二者同時敲除小鼠比TSC1單基因突變體小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的PKD[47]。DE STEPHANIS等[46]研究進(jìn)一步表明，PTEN和TSC1的3′UTR包含miR501-5p的多個識別位點,miR501-5p的上調(diào)可導(dǎo)致PTEN和TSC1表達(dá)水平降低,進(jìn)而激活mTOR激酶；另一方面，mTOR激酶的激活誘導(dǎo)癌基因MDM2的上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤抑制蛋白——p53的泛素化和降解，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，最終影響ADPKD的發(fā)展。同樣在腎癌細(xì)胞中也觀察到miR501-5p通過增強(qiáng)mTOR活性導(dǎo)致p53失活，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活[48]。因此，miR501-5p及其信號途徑可為ADPKD的治療藥物靶點提供新選擇。

3.7其他miRNA與ADPKD 在ADPKD組織和細(xì)胞系中miR-199a-5p顯著上調(diào)，并隨疾病進(jìn)展而增加，抑制miR-199a-5p表達(dá)可抑制囊腫細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)確認(rèn)周期蛋白依賴激酶抑制因子1C是miR-199a-5p的直接靶點，miR-199a-5p可能通過靶向周期蛋白依賴激酶抑制因子1C/p57發(fā)揮作用[49]。KOCYIGIT等[29]根據(jù)CKD分期對80例ADPKD患者進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中miR1260a、miR-1587、miR-21-5p、miR-3907、miR-3911、miR-92a-3p 均出現(xiàn)劑量反應(yīng)現(xiàn)象，并隨著腎小球濾過率下降至少增加2倍；隨訪1年后比較了所有患者所選變量與進(jìn)展結(jié)果的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，腎小球濾過率估計值下降大于10%與年齡、CKD分期和miR-3907獨立相關(guān)。另外，在ADPKD患者中提取尿液外泌體miRNA發(fā)現(xiàn)了7個腎臟富集的miRNA，即miR-194-2簇(miR-1925p和miR-194-2-5p)、miR-194-1-5p和miR-30家族的4個成員(miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30d-5p和miR-30e-5p)的表達(dá)低于健康對照組，這些miRNA在晚期ADPKD患者中的表達(dá)均有顯著變化，而在早期ADPKD患者中只有miR-194-1-5p、miR-194-2-5p的表達(dá)顯著低于對照組[50]。近年來，miRNA與自噬的關(guān)系也得到研究，有研究證實，miR-25-3p在PKD小鼠中上調(diào)，抑制miR-25-3p可通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白14促進(jìn)PKD小鼠細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖[51]。

4 小 結(jié)

ADPKD是腎衰竭常見且難以治愈的病因之一，近年來，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在ADPKD中異常表達(dá)，并與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此，本文就相關(guān)miRNA與ADPKD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系進(jìn)行了綜述，旨在為治療ADPKD的靶點選擇提供一些線索。但目前大多數(shù)miRNA只在動物及細(xì)胞實驗中進(jìn)行了研究，尚未在臨床中得到驗證；此外，仍有許多miRNA的功能及機(jī)制在ADPKD中尚未明確,因此，未來尚需要大量的研究探索miRNA在ADPKD發(fā)生、發(fā)展中的作用，以發(fā)掘ADPKD的潛在生物標(biāo)記物及治療靶點。