江 蕾，黎純敏，曾育麟

(西昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615000)

0 引言

隨著社會(huì)發(fā)展，動(dòng)物交易方式方法越來越多，動(dòng)物疫病隨著動(dòng)物交易與運(yùn)輸，流傳速度越來越快，流傳范圍也越來越廣，表現(xiàn)癥狀也越來越復(fù)雜。動(dòng)物疫病的診斷與防控已無法完全依靠肉眼判斷的結(jié)果進(jìn)行，需要獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相應(yīng)的動(dòng)物疫病試驗(yàn)支持。基層獸醫(yī)人員在接到動(dòng)物疫病發(fā)生報(bào)告或排查過程中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物疫病時(shí)，須第一時(shí)間到達(dá)動(dòng)物疫病發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并根據(jù)不同的動(dòng)物疫病檢測(cè)要求采集不同的樣品送獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)試驗(yàn)。所以，基層獸醫(yī)人員對(duì)動(dòng)物疫病樣品的采集質(zhì)量是動(dòng)物疫病的診斷與防控的基石。本文主要針對(duì)動(dòng)物的血樣、組織樣品及拭子等動(dòng)物疫病常見樣品的采樣原則、操作方法及注意事項(xiàng)進(jìn)行探討。

1 采樣的一般原則

1.1 活畜禽

1)血液樣品:在采樣前一般禁食8 h，然后根據(jù)采樣對(duì)象、檢驗(yàn)?zāi)康募八璧难看_定采血的方法與采血部位。禁止采集血腫部位血液。

2)體表樣品:采集病變部位與健康部位的交界處、病變部位。

3)拭子:拭子須在指定部位充分旋轉(zhuǎn)。

4)血紙:血液量須浸透采集紙片。

5)糞便：必須是新鮮糞便。

1.2 動(dòng)物尸體

1)血液。凡是血液凝固不良、天然孔出血的病死動(dòng)物，首先排除炭疽，然后采集耳尖血。

2)組織樣品。①應(yīng)從胸腔到腹腔，先采實(shí)質(zhì)臟器，最后采腔腸器官等部位，盡量無菌采集，避免外源性污染。②采取的病料必須有代表性，采取的臟器組織應(yīng)為病變明顯部位和健康部位交界處、病變部位，根據(jù)不同的疫病或檢驗(yàn)?zāi)康牟扇∠鄳?yīng)的組織樣品。③死亡時(shí)間不超過6 h。

1.3 環(huán)境拭子

選取有代表性的環(huán)境進(jìn)行采樣。

1.4 生物安全

1)個(gè)人安全。在進(jìn)入每個(gè)采樣場(chǎng)地前需要做好個(gè)人防護(hù)，有條件的使用一次性防護(hù)用品，無條件的須在進(jìn)入下一個(gè)場(chǎng)地前對(duì)全部個(gè)人防護(hù)用品使用消毒藥或是酒精消毒。

2)動(dòng)物安全。在采集每一份樣品時(shí)，都必須使用一次性采樣器械，禁止混用。

3)環(huán)境安全。①解剖動(dòng)物尸體時(shí)，須防止血水等對(duì)環(huán)境的污染。②采樣過程中和采樣結(jié)束后產(chǎn)生的各種垃圾，禁止隨意丟棄，須考慮環(huán)境影響等，做好無害化處理。

1.5 采樣順序

首先采集活畜禽樣品，然后再采集動(dòng)物尸體。

2 采樣前的準(zhǔn)備

按照參與人員與樣品采集數(shù)量進(jìn)行匹配準(zhǔn)備。

2.1 器具的準(zhǔn)備

1)采樣器具:采樣箱、解剖器械、普通真空采血管(針)、抗凝血真空采血管(針)、注射器、酒精棉球、干棉球、采樣刀剪、推毛剪、5 mL離心管、醫(yī)用棉簽(棉花頭無飛絮)、采血濾紙等。

2)輔助器材:冷藏箱、冰袋、雙頭油性記號(hào)筆(一頭筆尖為0.5 mm)、簽字筆、試管架、密封袋、采樣登記表、PBS液(病毒保存液)、利器盒、無害化處理袋等。

2.2 防護(hù)用品的準(zhǔn)備

一次性防護(hù)服、一次性乳膠手套、口罩、防護(hù)帽、鞋套、護(hù)目鏡、面罩、肥皂、免洗酒精等。

2.3 人員準(zhǔn)備

至少需要3人，保定人員1人以上，采樣人員1人，采樣助手1人以上。保定人員負(fù)責(zé)保定，采樣人員負(fù)責(zé)采樣，采樣助手負(fù)責(zé)登記、編號(hào)、輔助采樣等。

3 采樣方法

采樣方法有采血、采拭子(環(huán)境拭子、咽泄鼻眼拭子)、采組織樣等。

3.1 采血方法

采血主要針對(duì)豬、牛、羊和禽，不同的動(dòng)物采血部位與采樣器械均不同。

1)真空采血針采血。該采血法適用豬、牛、羊、禽身體表面靜脈血管采血。具體步驟：用酒精棉球?qū)⒉裳课幌?酒精棉球同時(shí)可以起到刺激血管作用讓血管凸起方便采血)，待酒精干后，采血針要順著血管水平方向進(jìn)針，針尖斜進(jìn)口向上并與皮膚呈30°～45°，針尖刺入血管后立即改變傾斜度，需要順著血管水平方向前進(jìn)1/3～2/3針頭，并固定針頭，讓其斜進(jìn)口面對(duì)采血人。采血針刺入后血管后，采血針與軟管交界處出現(xiàn)血液說明針尖進(jìn)入血管，可以繼續(xù)采血，否則需要重新更換未使用過的采血針換個(gè)采血部位再按以上步驟進(jìn)行?？梢圆裳?，將出血針頭插入采血管中，讓血液順著管壁流下，不要讓血液對(duì)著管底猛沖，待血量達(dá)到要求后(3～5 mL)，用干棉球按壓針眼，拔出采血針頭，輕壓止血。在采血管上1/3處用油性記號(hào)筆做好唯一性標(biāo)記。

2)采血盛血器采血。該采血法適用豬、牛、羊、禽身體表面靜脈血管、豬前腔靜脈采血。①身體表面靜脈血管采血。用酒精棉球?qū)⒉裳课幌?，待酒精干后，針頭要順著血管水平向進(jìn)針，針尖斜進(jìn)口向上并與皮膚呈30°～45°，針尖刺入血管后立即改變傾斜度，需順著血管水平方向前進(jìn)1/3～2/3針頭，并固定針頭，讓其斜進(jìn)口面對(duì)采血人。針頭刺入血管后，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，針頭與針身交界處出現(xiàn)血液說明針尖進(jìn)入血管，可以繼續(xù)采血，否則需要重新更換未使用過的采血盛血器換個(gè)采血部位再按以上步驟進(jìn)行?？梢圆裳?，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，讓血液緩慢順著管壁流下，待血量達(dá)到要求后(3～5 mL)，用干棉球按壓針眼，拔出針頭，輕壓止血。在采血盛血器靠近針頭的前1/3處用油性記號(hào)筆做好唯一性標(biāo)記。②豬前腔靜脈采血。用酒精棉球?qū)⒉裳课幌?，待酒精干后進(jìn)行采血。針筒一般為5 mL或10 mL的一次性針筒。由于豬的大小不同，前腔靜脈的深淺不一樣，要求使用的針頭是不一樣的。針頭太短刺不到前腔靜脈，針頭太長，則可能刺穿前腔靜脈，同樣采不到血。成年公母豬宜選用16號(hào)(45或50 mm)針頭，30 kg以上的成年豬和育成豬選用12號(hào)(38 mm)針頭，10～30 kg的仔豬選用9號(hào)(25 mm)針頭，10 kg以下仔豬選擇9號(hào)(20 mm)針頭。15 kg的豬可以仰臥保定，在左側(cè)前腔最凹陷處處垂直進(jìn)針，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，針頭與針身交界處出現(xiàn)血液說明針尖進(jìn)入血管，可以繼續(xù)采血，否則需重新更換未使用過的采血盛血器并換只豬再按以上步驟進(jìn)行?？梢圆裳?，一只手固定針頭，一只手緩慢抽取血液，讓血液緩慢順著管壁流下，待血量達(dá)到要求后(3～5 mL)，用干棉球按壓針眼，拔出針頭，輕壓止血。在采血盛血器靠近針頭的前1/3處用油性記號(hào)筆做好唯一性標(biāo)記。

3.2 采血部位與保定方法

1)豬的采血與保定方法。①耳靜脈。適用于耳靜脈明顯且較粗的豬，多為經(jīng)產(chǎn)母豬、公豬、肥豬。保定人員將豬站立或臥倒保定好，特別是將豬耳朵固定好讓其不能晃動(dòng)或搖動(dòng)，采樣助手用手按壓住耳根處，讓耳朵上的靜脈血管充分暴露。采樣人員左手牽拉豬耳，讓其完全展開，然后采用真空采血針采血方法進(jìn)行采血。先從耳靜脈遠(yuǎn)心端向近心端進(jìn)針，一處無法采出血液，將采血處向比前一次采血處靠近心端的血管處移動(dòng)或是換只耳朵，禁止采集血腫處的血液。②前腔靜脈。主要適用于15 kg以下的仔豬，保定人員將其仰臥解剖位或是直立保定，采樣人員采用豬前腔靜脈采血方法進(jìn)行采血。

2)牛的采血與保定。①頸靜脈。適用于有保定架或是類似的保定裝置的地方，保定裝置不能被牛隨意移動(dòng)或折斷。保定人員將牛頭頸部保定好，使牛頭向牛身右側(cè)偏仰，采樣人員用左手大拇指和其余四指卡住牛頸靜脈近心端，讓頸靜脈充分暴露出來，然后采用真空采血針采血方法順著頸靜脈遠(yuǎn)心端進(jìn)行采血。右側(cè)頸靜脈無法采血或是采血到一半時(shí)牛掙脫開采血針，需要換左側(cè)頸靜脈采血。②尾靜脈。適用于有柱子或是類似裝置的地方。將牛栓在柱子上，將其尾根部提起，在離尾根10 cm左右，第4、5尾椎骨交界中點(diǎn)凹陷處用酒精消毒后垂直進(jìn)針。一般采用真空采血針采血方法進(jìn)行采血。采血到一半時(shí)牛掙脫開采血針，應(yīng)換一頭牛進(jìn)行采血。

3)羊的采血與保定。羊采用頸靜脈采血操作。保定人員將羊站立保定好，羊頭向羊身左側(cè)偏仰，毛長的羊要用推毛剪將采血部位頸靜脈處毛除去。采樣人員用左手大拇指和其余四指卡住羊頸靜脈近心端，讓頸靜脈充分暴露出來，然后采用真空采血針采血方法順著頸靜脈遠(yuǎn)心端進(jìn)行采血。右側(cè)頸靜脈無法采血或是采血到一半時(shí)羊掙脫開采血針，應(yīng)換左側(cè)頸靜脈采血或是換一頭羊進(jìn)行采血。左側(cè)頸靜脈采血，羊頭向羊身右側(cè)偏仰。

4)禽的采血與保定。①翅靜脈。保定人員將禽保定，右側(cè)向上，采樣人員或采樣助手牽拉右翅，將右翅暴露出來，扯掉右中翅處羽毛，暴露靜脈血管。采樣人員采用采血盛血器采血方法進(jìn)行采血。如果左中翅沒有采血成功，換同一只雞的右中翅或換只雞進(jìn)行采血。禁止采集血腫處血液。②趾靜脈。保定人員將禽保定，左側(cè)向上，將右腳暴露出來。從右腳第一趾和第二趾處尋找比較粗的趾靜脈。采樣人員采用采血盛血器采血方法進(jìn)行采血。

3.3 采集拭子樣品

1)環(huán)境拭子。在養(yǎng)殖場(chǎng)、辦公區(qū)、生活區(qū)的不同地方(具有代表性和容易藏污納垢的地方)，比如圈舍過道、飼槽、圈舍壁、排糞污口(溝)、飼料推車、辦公室、生活間等地方進(jìn)行采樣，采樣人員用棉簽在這些地方反復(fù)擦拭數(shù)次后保存在裝有PBS液的5 mL離心管內(nèi)，并做好采樣登記與唯一性標(biāo)識(shí)。棉簽在裝入離心管時(shí)，需在管口將棉棒去掉，只保留棉頭進(jìn)入離心管。一個(gè)離心管裝多個(gè)棉頭時(shí)，棉頭與棉頭、棉頭與離心管之間需保留一定縫隙，以便棉頭充分吸取PBS液。樣品唯一性標(biāo)識(shí)用油性記號(hào)筆標(biāo)記在離心管管蓋上。

2)咽泄、眼、鼻拭子。將干棉簽伸入咽喉部、泄殖腔1.5～2 cm處或眼鼻處輕輕擦拭幾次后保存于裝有PBS液的5 mL離心管內(nèi)，并做好采樣登記與唯一性標(biāo)識(shí)。棉簽在裝入離心管時(shí)，需要在管口將棉棒去掉，只保留棉頭進(jìn)入離心管。一個(gè)離心管裝多個(gè)棉頭時(shí)，棉頭與棉頭、棉頭與離心管之間需保留一定縫隙，以便棉頭充分吸取PBS液。樣品唯一性標(biāo)識(shí)用油性記號(hào)筆標(biāo)記在離心管管蓋上。

3.4 采集血紙

主要針對(duì)不方便固定保定采血的牛。保定人員將牛頭牽住，使用無菌針頭戳穿牛耳朵上的靜脈血管，用采血紙吸取血液浸透至少0.5 cm×0.5 cm大小。在血紙上做好唯一性標(biāo)識(shí)與采樣登記。待血紙陰涼晾干后再與其他采集好的血紙集中存放。

3.5 采集糞便

采集24 h內(nèi)離采集時(shí)間最近的糞便，做好采樣登記與唯一性標(biāo)識(shí)。

1)從地上采集牛、馬糞便需要采集糞便中間，每份糞便為成年男人拳頭大小。

2)從地上采集羊、禽等糞便需要采集最新鮮的糞便，能區(qū)分單樣的保存為單樣，不能區(qū)分的保存為混合樣品。

3)羊糞便樣品需要和羊只一一對(duì)應(yīng)時(shí)，應(yīng)采集直腸糞便，助手將羊站立保定，采樣人員左手抬起羊尾，右手戴上指套的食指直接從羊肛門處摳取羊糞，每份樣品至少20粒羊糞。

3.6 采集組織樣品

采集組織樣品主要針對(duì)病死動(dòng)物。應(yīng)根據(jù)臨床癥狀或剖解的初步診斷，有選擇地采取組織樣品，難以判定疑似病種的要全面采集病料。采取的病料必須有代表性，采取的臟器組織應(yīng)為病變明顯部位和健康部位交界處、病變部位，大小為1 cm×1 cm。應(yīng)從胸腔到腹腔，先采實(shí)質(zhì)臟器，最后采腔腸器官等部位，盡量無菌采集，避免外源性污染。

根據(jù)不同的疫病或檢驗(yàn)?zāi)康牟扇∠鄳?yīng)的組織樣品。病料采集后直接保存于滅菌后的采集管內(nèi)，并做好采樣登記與唯一性標(biāo)識(shí)。

4 注意事項(xiàng)

1)做好生物安全防護(hù)，個(gè)人、動(dòng)物、環(huán)境安全缺一不可。采樣過程中產(chǎn)生的廢棄物須有防泄漏容器收集后做無害化處理。

2)不建議使用大號(hào)注射針頭加真空采血管的方法進(jìn)行采樣。原因一是無法控制血流采集速度，血液凝集后易形成果凍樣，無法分離得到試驗(yàn)用血清；二是對(duì)被采血?jiǎng)游镌斐傻膭?chuàng)口可能被自體血壓擴(kuò)大，不利于被采血?jiǎng)游锘謴?fù)。

3)不建議使用注射器采血與保存血液。原因一是使用注射器采血并保存血液后，無法分離得到試驗(yàn)用血清；二是使用注射器采血后，使用注射器將血液注射保存于其他容器內(nèi)，血液凝集后易形成果凍樣，無法分離得到試驗(yàn)用血清。

4)采血盛血器不是注射器，是專用的采血工具。

5)禽采血一般采用采血盛血器采血方法。不建議使用真空采血針采血方法，原因一是使用真空采血針采血后，采血真空壓力瞬間過大，采血針頭極容易被壓在靜脈壁上，不利于血液采集；二是使用真空采血針采集的禽血，血液凝集后易形成果凍樣，無法分離得到試驗(yàn)用血清。

6)在采血過程中一定要讓血液順著管壁緩慢流下，不要讓血液對(duì)著管壁或管底猛沖，因?yàn)檫@樣會(huì)破壞血細(xì)胞造成溶血影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7)抗凝血?jiǎng)?yīng)按照疫病檢測(cè)種類進(jìn)行選擇，如檢測(cè)非洲豬瘟的抗凝血?jiǎng)┬栌靡叶匪囊宜岫c。

8)采集抗凝血時(shí)一定要注意，采好血樣時(shí)要將管子上下輕輕顛倒幾次讓血液和管子里的抗凝劑充分混合，以防止血液凝集。

9)在采集環(huán)境拭子時(shí)，可沾取無菌生理鹽水或PBS液擦拭環(huán)境。

10)采樣過程中一定要做好采樣表登記和樣品唯一性編號(hào)，且登記編號(hào)和樣品編號(hào)相符，以便回溯檢測(cè)結(jié)果。

11)樣品的唯一性編號(hào)須跟隨樣品，不易丟失、模糊、擦除，建議使用油性記號(hào)筆在樣品上或樣品保存容器表面醒目處進(jìn)行標(biāo)記。

12)采好的樣品須防泄漏并冷藏運(yùn)輸。非抗凝樣品在運(yùn)輸過程中盡量避免晃動(dòng)。

13)如果樣品在24 h內(nèi)無法送達(dá)實(shí)驗(yàn)室：48 h內(nèi)能送達(dá)的樣品保存在8℃以下的冷藏室中；2～7 d才能送達(dá)，血液樣品須分離提取血清，與組織樣品等保存在低于-20℃下的冰柜中；7 d以上才能送達(dá)，血液樣品須分離提取血清，與組織樣品等保存在低于-70℃下的冰柜中。

5 結(jié)語

動(dòng)物疫病的確診需要實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果支持，樣品的真實(shí)性和準(zhǔn)確性極大的影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。只有采樣人員具備專業(yè)的采樣技術(shù)和能力，才能夠按不同的疫病要求采集不同的合格樣品，為動(dòng)物疫病的防控提供有效的技術(shù)支撐。