陳智麗

（南京市溧水區(qū)永陽街道畜牧獸醫(yī)站，江蘇 南京 211200）

牛病毒性腹瀉-粘膜病需要采用實驗室檢測對病毒進行識別，為病毒診斷提供有效依據(jù)。隨著對牛病毒性腹瀉-粘膜病診斷技術的深入研究，已經(jīng)建立了多種診斷牛病毒性腹瀉粘膜病的診斷方法，本文將主要的方法介紹如下，供參考和選擇。

1 臨床表現(xiàn)

牛病毒性腹瀉-粘膜病是由牛病毒性腹瀉病毒感染引起，對牛具有較大的危害，該病的潛伏期7～10d。該病的臨床癥狀比較明顯可分急性和慢性兩種。（1）急性病癥 潛伏期一般在1周左右，病牛將出現(xiàn)持續(xù)高燒、精神不振等癥狀。嚴重時，將會引發(fā)腹瀉，致使牛體內(nèi)水分流失，使其體溫升高，進而引發(fā)牛的死亡。（2）慢性病癥 病牛的體溫長期偏高，臨床表現(xiàn)不如急性腹瀉劇烈，但同樣會對牛造成較大影響。而且，牛的眼角、鼻腔會出現(xiàn)大量的分泌物，導致牛逐漸消瘦，使其失去健康的體征。該病后期，病牛會極度消瘦，黏膜會出現(xiàn)大量的充血，腸道伴有粘液、氣泡等，導致牛無法正常采食，使其逐漸衰弱而死亡。所以，需要做好該病的防治工作，避免該病的發(fā)生和流行，應結合實驗室診斷的方式，使病變能夠得到及早預防，降低粘膜病對牛的影響。

2 實驗室診斷技術

2.1 免疫過氧化物酶技術該技術具有較強的可靠性，診斷結果較為準確。采用該技術檢測時，需要對BVD-MDV抗原進行檢測，對其分布狀況進行確定，對抗原，需要采用過氧化物酶進行處理，制作組織切片，抗原將固定在組織中，確?？乖瓩z測精確度。切片需要采用0.02%蛋白酶進行處理，在4℃環(huán)境下，對切片進行消化處理，提高切片對酶的親和度。牛病毒性腹瀉—粘膜病屬于持續(xù)性的病毒血癥，對組織的影響較為嚴重，對病毒抗原應進行嚴格檢測，提高病原檢測技術的有效性。對BVD-MDV可以采用間接鑒定形式，通過過氧化物酶對切片的著色檢查，借由免疫熒光法進行檢驗，進而可以通過顯微鏡進行觀察，確保染色后的細胞能夠肉眼可見。

2.2 蛋白A膠體金免疫電鏡技術電鏡檢查是病毒診斷的重要方式，能夠?qū)崿F(xiàn)病毒粒子的檢測，對病毒粒子進行敏感識別。電鏡技術對病毒粒子數(shù)量具有一定的要求，需要控制在107個/mL，保證病毒能夠通過電鏡進行識別。電鏡技術需要采用高速離心操作，對病毒液進行濃縮處理，以降低對病毒鑒定的難度。電鏡具有較高的檢測密度，可以在低倍數(shù)的情況下進行檢查，使病毒檢測便具可靠性，提高對病毒的識別能力。在蛋白A膠體金免疫的作用下，實現(xiàn)對抗原-抗體復合物的識別，使其形成抗體橋的形式，使金顆粒能夠分布在抗橋的周圍，確保病毒構造的清晰程度。該診斷技術檢測過程較為迅速，對病毒的識別較為敏感，在診斷時間方面，僅用3～4h便可完成檢驗。電鏡技術可對病毒的特征進行識別，對病毒囊膜上的纖突進行確定，檢測具有較高的敏感性。

2.3 核酸雜交技術核酸雜交技術是較為新穎的診斷技術，并且實驗要求較高。核酸雜交可以對病變細胞進行識別，通常采用基因探針識別的方式，對病變細胞的基因序列進行檢驗。核酸雜交技術具有較強的敏感性，屬于基因檢測范疇，要重視探針的使用方法，提高探針的應用水平。應用該技術時，需要采用雜交方式進行診斷，通過對雜交率進行分析，對病毒對細胞的感染情況進行判斷。基因探針具有較強的針對性，其診斷精度很高，診斷過程中具有較高的檢出率。核酸雜交技術的難點在于對探針的制作，需要以病毒核酸作為制作探針的依據(jù)，確保探針能夠?qū)Σ≡催M行精準識別，保證雜家技術應用的合理性。

2.4 聚合酶鏈反應技術該技術具有較高的敏感性、特異性，操作比較方便，適用于對病變細胞的檢測。聚合酶鏈反應需要對引物進行DNA的序列層面擴增，同時需要在正常細胞中培養(yǎng)，將病變細胞與其進行對比，使病毒的檢測更加的標準化。在聚合酶的作用下，可以對病毒進行反轉(zhuǎn)錄，提高病毒檢測的敏感性。檢測過程中，敏感度的臨界值為半數(shù)組織培養(yǎng)感染量，能縮短診斷時間，提高細胞檢測的有效性。聚合酶鏈反應屬于基因?qū)用娴臋z測，一般采用特異性引物，提高DNA序列的轉(zhuǎn)錄效率，保障病毒診斷能夠順利進行。

2.5 病毒分離鑒定技術病毒分離鑒定技術是指在血清中分離病毒，并對其進行鑒定，進而診斷疾病的技術，此種技術應用較為成熟，屬于病原鑒定的重要技術手段之一。在技術應用的過程中，需要對接種細胞進行培養(yǎng)，同時對細胞的病變情況。在實驗過程中，要采集病牛病料并分離病毒，接種到健康細胞中，經(jīng)過細胞傳代，分析病毒感染情況。為了確保病毒的分離效果，需要將病原接種到MDBK細胞中，經(jīng)過培養(yǎng)和傳代可發(fā)現(xiàn)細胞病變，經(jīng)過檢定后發(fā)現(xiàn)細胞呈現(xiàn)陽性，進而證明病毒為牛病毒性腹瀉病毒。病毒分離鑒定診斷是一種間接診斷方式，在外部對接種細胞進行培養(yǎng)，需要消耗一定數(shù)量的時間?；疾≡缙诓∨]有臨床表現(xiàn)，需要采用病原進行外部培養(yǎng)，以提高對病毒的診斷效率。病毒分離鑒定可通過細胞培養(yǎng)提高病原的數(shù)量，以提高整頓的精準性。

2.6 血清抗體檢測技術血清抗體檢測技術，是指采集液制備血清，對血清中的病毒抗體進行檢測，根據(jù)檢測結果診斷疾病的技術。診斷過程中，應當首先要進行人工感染，將病原注入到動物體內(nèi)，使其對體內(nèi)細胞進行感染，使病原能夠得到外部檢驗。通常，選擇小健康小白鼠進行試驗，將病料對小白鼠進行接種。（1）可將5mL病原上清液靜脈注射到小白鼠體后正常飼養(yǎng)。（2）將2mL病原上清液由鼻腔滴入。接種后需要對小白鼠的臨床表現(xiàn)進行觀察，確定病原對小白鼠健康狀況的影響。同時，還要對小白鼠進行病毒分離及血清抗體檢測，對病原進行進一步的診斷，確定病原是否在其體內(nèi)存活，若存活則牛病毒性腹瀉病毒進行診斷，確定是否由該病原引起小白鼠患病。

2.7 電鏡技術電鏡技術又稱電子顯微鏡技術，屬于細胞生物學研究手段之一，可對細胞亞顯微結構和病毒進行觀察，從而達到診斷疾病的目的。檢測前需要對病原進行培養(yǎng)，使病毒能夠達到一定的數(shù)量，確保電鏡下能夠?qū)Σ《具M行識別。電鏡檢驗需要對病料進行處理，將病料制成超薄切片形式，采用電鏡確定病毒粒子的形態(tài)，對病毒的體征進行判斷。但病毒粒子的數(shù)量需要控制在10-6/mL以上，才能符合電鏡觀察的要求。同時，可對病原進行細胞培養(yǎng)，將病料接種到MDBK細胞中，將其繁衍10代左右。采用電鏡技術觀察細胞培養(yǎng)物，對牛病毒性腹瀉病毒進行檢驗?？梢姷讲《倦x子呈現(xiàn)圓形、有囊膜、有突起等特征，直徑在40～60nm。

2.8 特異性抗體檢測技術特異性抗體技術主要指中和實驗，通過對細胞的定性檢驗，實現(xiàn)對疾病的診斷?？蓪⑴２《拘愿篂a病毒接種在睪丸細胞或犢牛腎細胞中，并進行細胞形態(tài)觀察。經(jīng)過2～3周后，采用被檢血清與接種細胞稀釋液進行混合，若檢測結果為陽性，則說明有牛病毒性腹瀉病毒存在。中和實驗診斷方式具有較高的檢出率，便于進行定性、定量檢驗，屬于常用的實驗室檢測方式。中和實驗診斷是病毒或毒素與相應抗體結合后，失去對易感動物的致病力和試驗方法，該法敏感性強特異性高使用范圍廣?？啥ㄐ詸z測，也可定量檢測。

2.9 瓊脂擴散技術瓊脂擴散技術原理簡單，但僅能夠?qū)崿F(xiàn)粗略檢驗，檢出率難以達到精準的水平，此項技術的優(yōu)勢在于能夠?qū)ζ渌\斷結果進行佐證，常用于對其它診斷方式進行驗證。在使用該診斷技術時，需要以病變組織作為實驗部位，將其與陽性血清混合進行瓊脂擴散。在實驗過程中，血清滴度應控制為1:2，將血清分為若干份進行實驗，這樣可以提高檢測結果的精度，促進瓊脂擴散實驗檢出率的提升。瓊脂擴散診斷成本較低，檢驗過程較為快速，是牛病毒性腹瀉病毒診斷的重要方式。瓊脂擴散實驗的檢出率在70%～80%，檢出率受到病原數(shù)量的影響，一旦檢測出病原且結果為陽性，則說明病變部位存在牛病毒性腹瀉病毒，需要做好該病的應對工作。

2.10 免疫熒光技術免疫熒光技術是科研機構實驗室中的重要診斷方式，檢測前，需要對病毒粒子進行培養(yǎng)，采用熒光法對其進行標記，使病毒粒子能夠以熒光的形式呈顯，便于對病毒進行鑒定。在試驗過程中，需要以病牛血清作為實驗材料，采用熒光法對抗體進行標記，使得診斷技術具有較高的特異性，可以增強對病毒的識別效率，使檢出率能夠達到98%以上。免疫熒光技術敏感性較高，對病毒的檢測速率較快，在需要快速得出診斷結果的情況下，采用該診斷技術較為適宜。然而，該診斷技術的缺點是無法對非特異性病原進行檢測。

2.11 酶聯(lián)免疫吸附技術酶聯(lián)免疫吸附技術要求對抗原以及抗體進行固化，在此基礎上，加入其它物質(zhì)，形成抗原抗體復合物，通過檢測，可產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過定量分析診斷疾病。在技術應用的過程中，需要嚴格做好病毒分離操作，提高病毒診斷的效率。在病毒分離檢測過程中，采用多樣本檢測的方式，取400份牛血清樣品進行實驗，對血清采用檢驗手段。其中，182份血清呈現(xiàn)陽性，218份血清呈現(xiàn)陰性。酶聯(lián)免疫吸附試驗是重要的診斷形式，可以對血清樣品進行檢驗，并且不需要較高純度的抗原，可以縮短病原的培養(yǎng)時間，提高對病原的檢測效率。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗原理，能夠?qū)崿F(xiàn)試紙的檢測形式，使病原診斷的操作更加方便。酶聯(lián)免疫吸附試驗對抗體檢測具有較高的靈敏度，在室溫下便可以進行實驗，便于將診斷技術進行推廣。該法具有快速、敏感性高、操作簡便、易于標準化等優(yōu)點，適合推廣使用。

2.12 分子生物學診斷技術分子生物學診斷技術要求以DNA以及RNA作為診斷用材料，通過相應的檢測技術觀察待檢測樣本中是否存在基因異常表達的情況，從而達到診斷疾病的密度。在分子生物學診斷技術應用的過程中，需要應用到反轉(zhuǎn)錄PCR，通過DNA的不同對病毒進行區(qū)分，以作為牛病毒性腹瀉病毒的診斷依據(jù)。分子生物學診斷需要注重機體的選擇，使機體具有良好耐受特征，確保病毒能夠快速地完成轉(zhuǎn)錄工作，確保病毒對細胞的感染能力。在分子生物學方面，具有完善的核酸檢測手段，可以通過探針來對牛病毒性腹瀉病毒的核酸進行檢驗，對特定的基因序列進行識別，對病毒實施精準化對檢驗。為了提高病毒檢測的精度，可以采用RT-PTR技術進行診斷，并且與熒光定量技術相結合，對檢測到的基因序列進行標記，進而實現(xiàn)感染細胞的熒光檢驗。另外，需要對抗原捕獲ELISA技術進行應用，提高病毒檢測的靈敏度，可以將靈敏度提升10倍以上，根據(jù)病毒的特異性進行診斷，豐富對牛病毒性腹瀉的臨床診斷經(jīng)驗。

3 結論

牛病毒性腹瀉—粘膜病是常見的牛病，需要注重實驗室診斷技術的應用，通過病原診斷、血清學診斷、分子生物等方面的應用，使腹瀉病原得到全面地檢測，確保診斷過程更加科學合理，提高了對病毒識別的有效性。實驗室診斷是診斷牛病的重要技術，需要嚴格按照實驗過程進行分析，提高對腹瀉病毒的診斷能力，保障牛病毒性腹瀉的診斷技術更加充分。