許珣，吳靜，朱翔，管政

IgG抗體是唯一可以通過胎盤屏障導(dǎo)致胎兒和新生兒溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)的一類抗體。IgG抗體亞類中，IgG3與其他亞類相比表現(xiàn)出最強(qiáng)的免疫學(xué)效應(yīng)[1]，但I(xiàn)gG3半衰期較短，僅為7天，且胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)不良，故其在HDFN發(fā)生及嚴(yán)重程度中作用較小[2]。但有研究[3]發(fā)現(xiàn)存在一種IgG3同種異型p.Arg435His-IgG3，其半衰期延長到21天，與其他亞類相當(dāng)，故這種同種異型p.Arg435His-IgG3在HDFN發(fā)生發(fā)展中可能比其他亞類抗體更具臨床意義。有報道[4]稱，p.Arg435His-IgG3在歐洲較為罕見(荷蘭為0.9%，芬蘭為0.4%)，但在亞洲族群中較為普遍(日本為28%)。目前，國內(nèi)少有關(guān)于p.Arg435His-IgG3的相關(guān)報道，為了闡明我國皖北地區(qū)p.Arg435His-IgG3同種異型的陽性率，我們對隨機(jī)抽取的皖北地區(qū)孕婦血樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序。現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)抽取2019年10月—2021年3月我院住院的177例產(chǎn)科患者血型或抗體效價的血液樣本，所有樣本均為3 d內(nèi)的EDTA抗凝血樣本，本研究獲得患者知情同意及我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 試劑與儀器 PCR儀(Verity 96well，美國ABI)、凝膠成像儀(FR-980A，上海復(fù)日科技有限公司)、測序儀(3730XL，美國ABI)、冷凍離心機(jī)(HC-2518R，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、臺式高速離心機(jī)(TD5A-WS，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)、電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)、電泳槽(DYCP-32B，北京六一儀器廠)、UV-Vis Spectrophotometer(SMA4000，Merinton)、微型旋渦混合儀(WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HS-800D，太倉市科教器材廠)；DNA Marker(SM0331)購自于ThermoFisher公司，Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、Taq Plus DNA聚合酶、10X PCR Buffer(含Mg2+)、dNTP、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA Marker(B500347)均購自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 實驗步驟

1.3.1 DNA提取 取200μlEDTA抗凝血，嚴(yán)格參照Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒說明書執(zhí)行DNA的提取。提取后取5 μl DNA溶液1%瓊脂糖、1X TAE緩沖溶液電泳(電壓120～180 V)檢測，單一條帶說明DNA完整無降解，有明顯的條帶說明濃度可以滿足PCR要求；采用分光光度計檢測濃度和純度，OD 260/280在1.7～2.0，說明DNA質(zhì)量較好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR體系為25μl,包含基因組模板DNA1μl、引物F和引物R各1μl、Taq酶0.2μl、10XTaq Buffer(with MgCl2)2.5μl、dNTP1μl；循環(huán)反應(yīng)溫度為95°C，5 min；94°C，30 S；63°C(每循環(huán)降0.5℃)，30 S；72°C，30 S；30個循環(huán)后72℃，10min結(jié)束擴(kuò)增。取PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物5 μl 1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳參數(shù)：150 V，100 mA，10～20 min，檢測PCR產(chǎn)物大小。采用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，序列如下：正向引物F 5’-ACCCAAGGATACCCTTATGATT-3’,反向引物R 5’-GAGGCTCTTCTGCGTGAAGC-3’，用于擴(kuò)增IgG3重鏈恒定區(qū)CH2和CH3的基因片段，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為683bp。

1.3.3 測序 目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶切膠純化回收，方法見SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，再采用Sanger測序法進(jìn)行測序，以AJ390235(IMGT基因庫登錄號)為參考序列，使用MegAlign軟件進(jìn)行測序結(jié)果比對分析，并以384位氨基酸密碼子突變作為實驗結(jié)果比對分析內(nèi)參突變點。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取及質(zhì)檢 1～10號檢測通道分別對應(yīng)編號為1～10號樣本,8～9號通道未有明顯條帶出現(xiàn)，經(jīng)檢測其濃度無法滿足后續(xù)的PCR擴(kuò)增，為3例無效樣本，其余樣本均質(zhì)檢合格，M通道為DNA Marker:Thermo(SM0331)。見圖1。

圖1 DNA提取檢測圖注：1～10號分別對應(yīng)1～10號樣品；M：Marker Thermo (SM0331)

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 抽樣檢測4個樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小，1～4號檢測通道分別對應(yīng)編號22、71、105、126的樣本，在600～700 bp,接近700 bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，與預(yù)期目的基因片段大小(683 bp)基本相符，M通道為DNA Marker: 生工(B500347)。見圖2。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖注：1～4號通道分別對應(yīng)隨機(jī)抽取的22、71、105、126號樣品,M:Marker生工(B500347)

2.3 基因測序

2.3.1 測序結(jié)果比對 以IGHG1(IMGT基因庫登錄號J00228)、IGHG2(IMGT基因庫登錄號J00230)、IGHG3(IMGT基因庫登錄號AJ390235)、IGHG4(IMGT基因庫登錄號K01316)為參考序列，通過MegAlign 軟件進(jìn)行比對，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的683bp的目標(biāo)片段符合IgG3序列特征，且僅有編號19的樣本在435位發(fā)生氨基酸密碼子的突變(g.1053927G>A)，陽性率約為0.57%。比對結(jié)果見圖3。

圖3 MegAlign 軟件序列比對圖注：IGHG1.seq、IGHG2.seq、IGHG3.seq、IGHG4.seq為參考序列，SC845-1-6.17,SC845-2-6.17,SC845-19-6.17分別代表編號為1,2,19號的樣本

2.3.2 實驗內(nèi)參突變點 384位氨基酸密碼子測序結(jié)果顯示,174例樣本中純合子AGC 30例、AAT 61例，雜合子AG/AC/T 83例。見圖4。

圖4 實驗內(nèi)參點384位氨基酸密碼子測序圖注：圖4A、4B為純合子，圖4C、4D為雜合子

3 討論

HDFN是由于母嬰不合的IgG類血型抗體通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒和新生兒體內(nèi)所引起的同種被動 免疫反應(yīng)[5]。IgG是唯一可以通過胎盤屏障的抗體，所以產(chǎn)前檢測母體內(nèi)IgG抗體效價是目前臨床預(yù)測HDFN發(fā)生及嚴(yán)重程度的一項重要指標(biāo)，但有研究[6-9]發(fā)現(xiàn)IgG抗體效價的高低與HDFN的發(fā)生及嚴(yán)重程度并非完全正相關(guān)，所以有學(xué)者[10-14]將研究方向轉(zhuǎn)移到IgG抗體亞類上來。IgG可以分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4這四種亞類,其中IgG3在誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒試驗(ADCC)、吞噬和補(bǔ)體激活方面均優(yōu)于其他亞類[1,3]。然而，金姣等[15]證實孕婦血清中抗A(B)IgG1水平過高是引起ABO血型不合的主要原因；侯玉濤等[16]通過對Rh陰性母親和新生兒血清中IgG及其亞型的相關(guān)性研究也進(jìn)一步證實了胎兒紅細(xì)胞上IgG1是引起Rh血型系統(tǒng)相關(guān)HDFN的主要亞類。由此可見，盡管IgG3可以介導(dǎo)最強(qiáng)的免疫效應(yīng)，但I(xiàn)gG1卻更具有臨床意義。其主要原因是二者半衰期的不同，而導(dǎo)致這種半衰期不同的原因是二者在435位存在單一氨基酸的差異，IgG3在此位置一般為精氨酸(Arg)，而IgG1為組氨酸(His)[4,17]。

新生兒Fc受體(FcRn)是IgG抗體的特異性受體[18-19]，它廣泛表達(dá)在人胎盤屏障中合胞體滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞內(nèi)部的酸性囊泡上，通過酸堿依賴的方式與IgG相結(jié)合。在酸性囊泡內(nèi)，IgG1-Fc段CH2-CH3鉸鏈區(qū)中的His435殘基發(fā)生質(zhì)子化，易與FcRn的酸性氨基酸殘基(Glu115和Asp130)相結(jié)合，當(dāng)結(jié)合體運(yùn)動到胎盤滋養(yǎng)層基底側(cè)時，F(xiàn)cRn與IgG1的親和力又因為His435的去質(zhì)子化而大幅度降低，從而釋放IgG1抗體到胎兒血循環(huán)中，F(xiàn)cRn再返回母體，轉(zhuǎn)運(yùn)更多的IgG1給胎兒[20]。所以，His435在介導(dǎo)FcRn-IgG1結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用，從而使IgG1擁有較長半衰期[21]。而IgG3在435位為Arg，Arg與His不同，在中性pH下并不去質(zhì)子，IgG3與FcRn結(jié)合的pH依賴性降低，最終被溶酶體降解，導(dǎo)致它在FcRn介導(dǎo)的運(yùn)輸和循環(huán)中失去競爭，從而影響IgG3的回收，繼而導(dǎo)致其半衰期極大地縮減，在胎盤中轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低，繼而影響IgG3在胎兒或新生兒體內(nèi)的免疫效應(yīng)作用。

目前研究[4，21]發(fā)現(xiàn)在人群中天然存在三種p.Arg435His-IgG3同種異型變異體V1、V2、V3，其435位氨基酸均為組氨酸，WHO血清學(xué)分型法將V1命名為G3m(15)、V2和V3命名為G3m(16)，三者半衰期與其他IgG亞類相當(dāng)，目前已證實這些IgG3同種異型具有重要的臨床意義。Celia等[22]對來自非洲西部貝寧瘧疾流行地區(qū)的個體研究表明，來自母體的抗瘧疾p.Arg435His-IgG3抗體從母體轉(zhuǎn)移到胎兒，對胎兒的保護(hù)作用明顯優(yōu)于IgG1或IgG3，降低了胎兒患瘧疾的風(fēng)險?；谏鲜鍪聦?，并結(jié)合前述的p.Arg435His-IgG3具有與IgG1相當(dāng)?shù)陌胨テ?，我們有理由推測p.Arg435His-IgG3血型抗體在HDFN的發(fā)生發(fā)展中可能具有同樣重要的臨床意義。

本研究僅發(fā)現(xiàn)一例IgG3在435位存在氨基酸密碼子的突變，陽性率為0.57%，這與已有的報道[4]存在差異。Helga等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在中國廣州地區(qū)G3m(16)陽性率為7.6%(132人中有10人)。究其原因，除了實驗方法和樣本量不同外，最大可能的原因就是地域差異本身造成的。

從方法學(xué)來講，目前已有的研究[18]使用經(jīng)典血凝抑制實驗，通過血清學(xué)分型來確定同種異型。我們知道IGHG基因具有高度同源性，當(dāng)G3m(16)抗體作為具有免疫原性的抗原與其他IgG3同種異型可能存在交叉抗原或者共同抗原，從而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性；另外也可能已知的檢測試劑抗G3m(16)多克隆抗體的特異性不高，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本研究考慮到多克隆抗體試劑的稀缺性及IGHG基因高度同源性[2,22]，我們設(shè)計一對特異性引物以獲得IgG3亞類特異性DNA擴(kuò)增后再測序，直接從基因?qū)用鎭頇z測IgG3抗體435位是否存在氨基酸密碼子的突變，排除了這種假陽性的可能性。Helga等[4]采用僅識別由292W (G3m(16)292位氨基酸為色氨酸W，G3m(15)292位為精氨酸R)編碼的抗原表位的1.5A10抗體來檢測G3m(16)，而本實驗可檢測所有在435位發(fā)生氨基酸非同義替換的IgG3同種異型，范圍包括G3m(15)和G3m(16)，所以從理論上分析本實驗結(jié)果應(yīng)高于已有的檢測結(jié)果。本實驗在設(shè)計初將384位氨基酸密碼子的突變作為試驗內(nèi)參突變點，測序結(jié)果顯示384位氨基酸密碼子存在突變，174例樣本中純合子AGC 30例、AAT 61例，雜合子AG/AC/T 83例，突變情況與文獻(xiàn)報道相符[2]，證實了本實驗方法的可靠性。

此外，由于本實驗采樣人群較少，采樣量也較少，可能并不能準(zhǔn)確反映皖北地區(qū)孕婦人群中p.Arg435His-IgG3的陽性率。

總之，本研究首次對皖北地區(qū)孕婦人群中p.Arg435His-IgG3進(jìn)行檢測，僅發(fā)現(xiàn)一例IgG3在435位氨基酸密碼子的突變，與已有相關(guān)性報道[4,22]存在差異，造成這種差異的原因可能是地域和方法學(xué)的不同以及小樣本量，后續(xù)我們將改進(jìn)實驗方法，并加大不同地區(qū)采樣量，以獲得我國孕婦人群中p.Arg435His-IgG3同種異型的更全面更精確的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究p.Arg435His-IgG3同種異型與HDFN的發(fā)生及嚴(yán)重程度提供理論依據(jù)。