胡 莉 白 辰 龍超君 朱敬儒 卓麗清 劉邵陽(yáng) 于 河 谷曉紅 劉鐵鋼

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

小兒肺炎是由病原體感染或其他因素所致的肺部炎癥，冬春季發(fā)病較多，臨床以發(fā)熱、咳嗽、痰壅、氣息、鼻煽為主要癥狀［1］。小兒肺炎是嬰幼兒死亡的常見(jiàn)原因，為我國(guó)重點(diǎn)防治的小兒疾病。西醫(yī)治療本病以予抗生素、抗病毒藥物等為主，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性以及許多不良反應(yīng)。中醫(yī)治療小兒肺炎在縮短疾病療程，改善臨床癥狀及減少不良反應(yīng)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

銀萊湯是首都名中醫(yī)谷曉紅教授的臨床驗(yàn)方，該方以肺與胃腸同治法組方，由金銀花、萊菔子、黃芩、連翹、魚腥草、全瓜蔞、前胡組成，肺胃兩清、宣通，臨床治療小兒胃腸積熱合并肺炎療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)，銀萊湯具有明確治療肺炎的作用［2-3］，但其作用機(jī)制并未明確。本研究建立脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的幼齡大鼠肺炎模型，旨在探究銀萊湯對(duì)幼齡大鼠肺炎模型的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，4周齡，體質(zhì)量（100±10）g，購(gòu)自維通利華（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)110011211102012854。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由攝食和飲水，室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜12 h交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)的規(guī)定和總則建議進(jìn)行（倫理審批號(hào)BUCM-4-2021030305-1046）。

1.2 試藥與儀器 銀萊湯中藥配方顆粒全方由金銀花30 g，萊菔子10 g，黃芩10 g，連翹15 g，全瓜蔞15 g，前胡10 g，魚腥草20 g組成，加水煎制濃縮為質(zhì)量濃度為0.56 g∕mL的藥液（藥材購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司）。LPS，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：L2880。醋酸潑尼松片，購(gòu)于浙江仙琚制藥股份有限公司。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA-Ki（t武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-R2856c）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA-Ki（t武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，EEL-R0015c）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA-Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-R0012c）。兔多抗tlr4（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，SC-109312）、兔多抗P65（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，10745-1-AP）；鼠單抗IκBα［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，4814］；兔單抗p-ikbα（美國(guó)Abcam公司，Ab133462）、兔單抗TRAF6（美國(guó)Abcam公司，Ab133462）、兔多抗myd88（美國(guó)Abcam公司，SC-109312）；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司，BA1051）、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司，BA1054）；ECL底物液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，P1050）。主要儀器：微型高速離心機(jī)，美國(guó)Labnet公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本ASONE公司；DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀、DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYY-7C電泳儀電源，北京六一儀器廠；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；402B超聲霧化機(jī)，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。

1.3 造模與分組 將4周齡大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、銀萊湯組、醋酸潑尼松組。

1.4 干預(yù)方法 模型組、銀萊湯組、醋酸潑尼松組每天早晚2次固定時(shí)間以LPS水溶液（0.5 mg∕mL）15 mL霧化吸入造模，每次30 min，連續(xù)3 d；正常組同樣的時(shí)間予以15 mL純水霧化吸入。每天早晚固定時(shí)間使用LPS霧化吸入建立肺炎模型后，銀萊湯組予5.6 g∕kg銀萊湯灌胃，醋酸潑尼松組予2.1 mg∕kg醋酸潑尼松溶液灌胃，共給藥3 d。3 d后大鼠禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛40 mL∕kg麻醉后進(jìn)行后續(xù)操作，從腹主動(dòng)脈采集血液，取肺組織。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）肺、胸腺臟器指數(shù)，腹主動(dòng)脈取血后，取大鼠肺和胸腺，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干燥。使用數(shù)字毫米秤稱重組織，計(jì)算臟器指數(shù)，公式如下：器官質(zhì)量∕體質(zhì)量×100%。2）大鼠切除肺臟稱重后，切取左肺一部分固定于10%甲醛溶液12 h，在石蠟包埋機(jī)中包埋后切成5 μm厚的切片，然后行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色。置于顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，觀察肺泡上皮細(xì)胞的損傷程度和肺泡壁增厚程度。3）ELISA測(cè)定血清中炎癥因子水平，大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后，3 000 r∕min 4℃離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的含量。4）Western blotting檢測(cè)大鼠肺組織蛋白表達(dá)水平，取大鼠的肺組織，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩７谓M織加入RIPA裂解液裂解勻漿，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH（1∶1 000）、TLR4（1∶800）、MyD88（1∶800）、TRAF6（1∶2 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、p-IKBα（1∶10 000）、IKBα（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，每次10 min，室溫二抗孵育90 min，TBST漂洗3次，每次10min，ECL反應(yīng)，采集圖像。采用Image J軟件分析灰度值以統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保留兩位小數(shù)，應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（）表示，以單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺、胸腺臟器指數(shù)比較 見(jiàn)表1。與正常組相比，模型組、銀萊湯組、醋酸潑尼松組大鼠的肺臟器指數(shù)均有不同程度的升高（P＜0.01）。與正常組相比，模型組、銀萊湯組大鼠的胸腺臟器指數(shù)有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），醋酸潑尼松組大鼠的胸腺臟器指數(shù)呈現(xiàn)明顯下降（P＜0.01）。

表1 各組大鼠肺、胸腺臟器指數(shù)比較（%，±s）

表1 各組大鼠肺、胸腺臟器指數(shù)比較（%，±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01。

組別正常組模型組銀萊湯組醋酸潑尼松組胸腺0.42±0.03 0.37±0.03 0.38±0.03 0.34±0.05**n 肺10 10 10 10 0.55±0.02 0.94±0.07**0.97±0.09**0.96±0.09**

2.2 各組大鼠肺組織病理變化 見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰完整，基本正常，未見(jiàn)出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常組比較，模型組大鼠肺組織細(xì)胞膜破壞，肺泡結(jié)構(gòu)雜亂，肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞。銀萊湯組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織均出現(xiàn)不同程度的病變改善。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，銀萊湯組和醋酸潑尼松組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較（pg∕mL，±s）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較（pg∕mL，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△P＜0.01。下同。

組別正常組模型組銀萊湯組醋酸潑尼松組n 6 6 6 6 TNF-α 140.45±14.27 465.83±35.08**318.14±21.14△△273.44±31.58△△IL-6 87.31±5.92 248.27±14.10**161.69±15.64△△144.81±14.55△△IL-1β 107.05±15.36 348.00±31.09**231.65±20.90△△194.09±17.03△△

2.4 各組大鼠肺組織蛋白水平比較 見(jiàn)表3，圖2。與正常組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα相對(duì)表達(dá)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），IKBα相對(duì)表達(dá)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，銀萊湯組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB-p65、p-IKBα蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），IKBα相對(duì)表達(dá)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65、p-IKBα、IKBα蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65、p-IKBα、IKBα蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別正常組模型組銀萊湯組醋酸潑尼松組n 3 3 3 3 TLR4 0.13±0.03 0.58±0.12**0.38±0.06△0.24±0.02△△MyD88 0.12±0.00 0.66±0.05**0.49±0.03△0.39±0.11△△TRAF6 0.14±0.03 0.64±0.06**0.43±0.03△△0.29±0.02△△NF-κB p65 0.24±0.08 0.82±0.08**0.56±0.07△△0.41±0.06△△p-IKBα 0.12±0.04 0.58±0.05**0.36±0.04△△0.25±0.05△△IKBα 0.54±0.04 0.11±0.01**0.27±0.07△0.35±0.06△△

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白表達(dá)比較

3 討論

小兒肺炎的急性病程以肺熱證為主，在此階段及時(shí)進(jìn)行干預(yù)是該病治療的關(guān)鍵。目前，在小兒肺炎肺熱證階段的治療以宣肺化痰為主，注重清熱解毒，治療病位主要在肺。銀萊湯是北京中醫(yī)藥大學(xué)谷曉紅教授的治療小兒肺炎的經(jīng)驗(yàn)方，以肺胃同治為主要治法［2］，由金銀花、萊菔子、連翹、黃芩、魚腥草、瓜蔞、前胡組成。回顧性病例系列研究發(fā)現(xiàn)，銀萊湯可明顯改善患兒機(jī)體狀態(tài)，治療效果總有效率可達(dá)95%，治愈率達(dá)85%［2-3］。研究表明，銀萊湯對(duì)發(fā)熱大鼠有明顯的抗炎退熱作用［4］，能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫球蛋白和細(xì)胞因子的分泌來(lái)調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，發(fā)揮其抗流感病毒的功效，達(dá)到治療食積復(fù)合流感病毒致小鼠肺部炎癥損傷的作用［5-7］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，銀萊湯可通過(guò)調(diào)控以TLRs、NF-κB、TNF等為主的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)宿主免疫炎癥反應(yīng)、血管生成和血管通透性、激素釋放和細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡，來(lái)減輕肺部炎性癥狀［8-9］。

Toll樣受體是一類模式識(shí)別受體（PRRs），它通過(guò)識(shí)別外源性、內(nèi)源性配體激活天然免疫［10］，其介導(dǎo)的信號(hào)通路在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11］。在經(jīng)典途徑中，TLR4的激活是從LPS與血清中LPS結(jié)合蛋白（LBP）相互作用開始的級(jí)聯(lián)事件［12］。TLR4∕NF-κB通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)的信號(hào)通路，NF-κB的異?；罨瘯?huì)引起炎性細(xì)胞因子的失控釋放，是導(dǎo)致肺損傷的重要機(jī)制［13］。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子受多種上游信號(hào)分子的刺激而激活，TLR4是其中之一。LPS作為TLR4的典型配體，能被TLR4識(shí)別并以LPSCD14-MD-2復(fù)合物的形式激活細(xì)胞內(nèi)的LPS-TLR4-MyD88-NF-κB 信號(hào)通路［14-15］。LPS刺激機(jī)體后，TLR4銜接蛋白MyD88募集IRAK4和IRAK1（或IRAK2）［16］；并激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），使其發(fā)生低聚化［17］；活化的TRAF6募集并激活 TGF-β活化激酶 1（TAK1），TAK1結(jié)合蛋白1（TAB1）和TAK1結(jié)合蛋白2（TAB2）形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物誘導(dǎo)激活I(lǐng)KKs復(fù)合物。NF-κB在靜息狀態(tài)下以三聚體形式的p50-p65-IκB存在于細(xì)胞質(zhì)中［18］。IKKs復(fù)合物是IκB激酶，主要由兩個(gè)催化亞基IKKα、IKKβ和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基IKKγ組成，是激活I(lǐng)κB的關(guān)鍵蛋白，也是NF-κB通路活化的主要啟動(dòng)點(diǎn)［19］。p65、IκBα的磷酸化水平是證實(shí)NF-κB通路活化的重要檢測(cè)指標(biāo)［20］。LPS可使IκB激酶激活致NF-κB磷酸化，IκB解離，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定的κB序列結(jié)合后活化和核轉(zhuǎn)移，高效誘導(dǎo)促炎因子、黏附分子及趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄［21］。其中誘導(dǎo)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生，促發(fā)更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，LPS激活了幼齡大鼠肺組織的TLR4，使得TLR4信號(hào)通路上的MyD88、TRAF6蛋白增多，促進(jìn)了IκBα磷酸化，致IκBα蛋白降低，p-IκBα蛋白數(shù)量增多，NF-κB磷酸化活化入核，促進(jìn)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的增加，造成肺部炎癥，損傷肺組織結(jié)構(gòu)。給予銀萊湯和醋酸潑尼松后，可減輕LPS引起的肺部炎癥和肺組織損傷，均可調(diào)控TLR4∕NF-κB信號(hào)通路上TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白水平的表達(dá)，及降低血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。另外，醋酸潑尼松雖能有效抗炎、抗過(guò)敏，降低毛細(xì)血管通透性，抑制結(jié)締組織增生，緩解炎癥癥狀，但該藥長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)明顯，臨床應(yīng)嚴(yán)格控制劑量及應(yīng)用時(shí)間［22-23］。與醋酸潑尼松組的模型動(dòng)物相比，銀萊湯組的胸腺指數(shù)變化不大，提示該方對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明銀萊湯給藥對(duì)LPS誘導(dǎo)的幼齡大鼠肺炎模型具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與減少肺部組織炎性病變、降低血清中炎癥因子水平以及下調(diào)TLR4∕NF-κB炎癥信號(hào)通路有關(guān)。