田彩平 李瑞 馬佰菁 閔建平 荊曉 楊碎勝

1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

眾所周知，癌癥是引起死亡的一個(gè)主要原因，也是世界性難題。若能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，就可以進(jìn)行早期干預(yù)，從而提高療效，減少死亡，因此腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要［1］。目前腫瘤標(biāo)記物、醫(yī)學(xué)影像以及穿刺活檢是主要的腫瘤診斷方式，其中腫瘤標(biāo)記物是檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中分泌到血液中的特異性蛋白質(zhì)含量，醫(yī)學(xué)影像是借助X 光、CT、核磁等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)病灶，穿刺活檢是通過(guò)穿刺或外科手術(shù)的方式取得腫瘤組織，這三種診斷方式均存在局限性，不能在腫瘤早期檢測(cè)到疾病信息而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，從而導(dǎo)致腫瘤患者治愈率低，生存期短［2］。因此，尋求一種能夠在腫瘤早期階段方便檢測(cè)的方法至關(guān)重要。

新興的液體活檢可以實(shí)時(shí)反映原始組織的生理和病理狀態(tài)，能夠在疾病早期被檢測(cè)出來(lái)，可以方便無(wú)創(chuàng)的取樣。與傳統(tǒng)有創(chuàng)的活檢相比，液體活檢具有及時(shí)、個(gè)體化診療的優(yōu)勢(shì)。然而，液體活檢在檢測(cè)靶標(biāo)的有效分離、信號(hào)放大等方面存在不足，而核酸適配體由于其特殊的空間構(gòu)象，可以進(jìn)行修飾和組裝，從而可以進(jìn)行信號(hào)放大，能夠彌補(bǔ)液體活檢存在的不足。本文從液體活檢的類型、優(yōu)缺點(diǎn)，核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用、優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行綜述，為腫瘤的早期檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1 液體活檢的主要檢測(cè)靶標(biāo)及在腫瘤檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)和不足

1.1 液體活檢的主要檢測(cè)靶標(biāo) 液體活檢是一種源自體液的疾病診斷和監(jiān)測(cè)工具，體液主要有血液、腦脊液、唾液、尿液等，它們要么在體內(nèi)循環(huán)，要么在體外分泌，具有營(yíng)養(yǎng)輸送、廢物收集以及潤(rùn)滑等一系列生理功能，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分析技術(shù)的發(fā)展，在體液中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的生物分子、細(xì)胞外囊泡甚至細(xì)胞，它們可以作為疾病管理的標(biāo)記物具有重要的臨床價(jià)值［3］。檢測(cè)分析這些體液靶標(biāo)（循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌體（Exosome）可以實(shí)時(shí)、全面、動(dòng)態(tài)的反映原始組織的全局生理和病理信息，其結(jié)果可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期篩查、指導(dǎo)治療、監(jiān)測(cè)療效和監(jiān)控復(fù)發(fā)［4-5］。

1.2 液體活檢在腫瘤檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)和不足 液體活檢與傳統(tǒng)腫瘤診斷方式相比，具有很多優(yōu)勢(shì)。首先，液體活檢能夠診斷出疾病的早期階段，使及時(shí)治療成為可能；其次，液體活檢可以方便且無(wú)創(chuàng)的進(jìn)行取樣，使疾病篩查更便捷，即使稀少的樣本也能檢測(cè)到，樣本還可以進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)和分析；再次，液體活檢能夠提供全面、動(dòng)態(tài)的病理信息來(lái)精準(zhǔn)全面的指導(dǎo)疾病診斷和治療方案［6］。同時(shí)它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中存在一些不足［7］，如CTCs 在體液中含量極低，很難被捕獲和識(shí)別到，并且體液是相對(duì)復(fù)雜的基質(zhì)，特別是外周血中有數(shù)十億血細(xì)胞和很多種蛋白質(zhì)，捕獲和識(shí)別都需要高效富集和高信號(hào)放大策略。ctDNA 存在檢測(cè)方法不統(tǒng)一，缺少標(biāo)準(zhǔn)化流程。外泌體在分離、分析靈敏度等方面技術(shù)受到限制。此外，脆弱的檢測(cè)靶標(biāo)需要溫和的分離和釋放方法進(jìn)行下游分析，不同程度的異質(zhì)性檢測(cè)靶標(biāo)需要綜合的檢測(cè)分析方法，克服這些困難需要高特異性和高靈敏度的靶標(biāo)檢測(cè)技術(shù)。核酸適配體檢測(cè)方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了液體活檢的不足。

2 核酸適配體的特性及其在不同腫瘤液體活檢中的應(yīng)用

2.1 核酸適配體的特性 近年來(lái)，廣泛研究的核酸適配體由于其具有獨(dú)特的空間構(gòu)象，能夠與病毒、細(xì)菌和細(xì)胞等多種靶點(diǎn)高特異的結(jié)合，它是利用指數(shù)富集的配基進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從大容量的寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)中迭代篩選出來(lái)的一類具有特異性識(shí)別功能的單鏈DNA 或RNA 核酸分子，它易于被合成，并根據(jù)靶標(biāo)特點(diǎn)通過(guò)體外方法進(jìn)行修飾，便于高效篩選到與核酸適配體高特異性、高親和力結(jié)合的檢測(cè)靶標(biāo)，更便于檢測(cè)信號(hào)的放大和檢測(cè)靶標(biāo)的充分釋放［8］。該技術(shù)于1990 年首次報(bào)道，后續(xù)開(kāi)發(fā)出了許多改良的SELEX技術(shù)，并結(jié)合高效的篩選平臺(tái)和生物信息學(xué)工具，核酸適配體檢測(cè)方法促進(jìn)了CTCs、ctDNA 和外泌體等液體活檢的發(fā)展，分別于2009 年、2012 年和2016 年探索了基于核酸適配體的檢測(cè)靶標(biāo)分離方法、釋放策略以及用于CTCs 研究的亞群分析平臺(tái)［9］。

2.2 核酸適配體在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用 核酸適配體在腫瘤診療中作為識(shí)別配體，其性質(zhì)決定其親和力、特異性和穩(wěn)定性等性能。親和力決定核酸適配體與檢測(cè)靶標(biāo)之間的結(jié)合力，從而影響檢測(cè)效率和靈敏度。核酸適配體的特異性識(shí)別保證了檢測(cè)的選擇性和可靠性，核酸適配體三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在實(shí)際應(yīng)用中非常重要。許多針對(duì)特定腫瘤生物標(biāo)志物的核酸適配體已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于液體活檢中檢測(cè)靶標(biāo)的捕獲和分析，比如黏液蛋白1（MUC1）和表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）的核酸適配體［10-11］，CD63 和 HSP70 的胞外結(jié)構(gòu)域已成為開(kāi)發(fā)特異性核酸適配體的目標(biāo)，用以分離和分析外泌體［12-13］。在此，我們總結(jié)了現(xiàn)有的一些成功應(yīng)用于不同腫瘤液體活檢的核酸適配體（表1）［14-16］。但是在親和力、特性性以及穩(wěn)定性方面還需大力提升，因此許多努力致力于研發(fā)親和力強(qiáng)、特異性高和穩(wěn)定性好的核酸適配體篩選方法。

表1 核酸適配體在不同腫瘤液體活檢中的應(yīng)用

3 核酸適配體檢測(cè)的靈敏度、特異性方面的優(yōu)勢(shì)

3.1 核酸適配體具有提高親和力的優(yōu)勢(shì) 核酸適配體的親和力決定了其結(jié)合性能，從而決定了檢測(cè)靶標(biāo)的高效分離和靈敏檢測(cè)，一些核酸適配體的親和力有限，同時(shí)復(fù)雜的基質(zhì)通常會(huì)對(duì)核酸適配體的親和力和穩(wěn)定性有害，因此提高核酸適配體的親和力是實(shí)際應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題在生物系統(tǒng)中引入多價(jià)核酸適配體，以增強(qiáng)核酸適配體與不同活性細(xì)胞的親和力，多價(jià)核酸適配體即一個(gè)實(shí)體上的多個(gè)配體與另一個(gè)實(shí)體上的一個(gè)或多個(gè)受體同時(shí)結(jié)合，受此啟發(fā)，核酸適配體采用各種策略來(lái)設(shè)計(jì)多價(jià)組件作為識(shí)別元素來(lái)提高親和力，常用的方法有雜交、聚合和基于納米結(jié)構(gòu)的多價(jià)組裝［17］。為了提高檢測(cè)靶標(biāo)的特異性，核酸適配體是在嚴(yán)格的篩選條件下和適當(dāng)?shù)南麥p條件下進(jìn)行篩選，如在連續(xù)流動(dòng)的微流控中進(jìn)行孵育有助于產(chǎn)生高度特異性的核酸適配體，與傳統(tǒng)的孵育方法相比，流動(dòng)的流量可以抑制大約50 倍的非特異性結(jié)合的寡核苷酸，因此消減篩選是消除寡核苷酸非特異性結(jié)合的關(guān)鍵過(guò)程。Li 等［18］利用高轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231 細(xì)胞進(jìn)行正向性篩選，利用低轉(zhuǎn)移性MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行反向篩選，實(shí)現(xiàn)了特異性靶向轉(zhuǎn)移細(xì)胞的適配體M3 的篩選，此外，基于M3 的捕獲系統(tǒng)成功地從轉(zhuǎn)移乳腺癌患者得到的轉(zhuǎn)移性表型細(xì)胞捕獲到了CTCs，因此，篩選高特異性識(shí)別的適配體有助于檢測(cè)靶標(biāo)的選擇性捕獲和分子分型。

3.2 核酸適配體具有多價(jià)組裝的優(yōu)勢(shì) 由于檢測(cè)靶標(biāo)存在于復(fù)雜的體液中，所以靈敏的檢測(cè)需要檢測(cè)靶標(biāo)的有效分離和富集，體液的復(fù)雜成分會(huì)影響檢測(cè)信號(hào)，尤其是血液樣本，一毫升血液中含有大于109個(gè)紅細(xì)胞、107個(gè)白細(xì)胞、大于108個(gè)血小板，以及幾十毫克的蛋白質(zhì)和有機(jī)小化合物，這種復(fù)雜的基質(zhì)會(huì)在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)引起電極污染，在光學(xué)檢測(cè)時(shí)引起自熒光、光散射以及吸附，因此檢測(cè)靶標(biāo)的有效分離和富集是提高檢測(cè)效率和靈敏度的關(guān)鍵。核酸適配體具有許多獨(dú)特的特性，首先，由體外SELEX 進(jìn)化而來(lái)的各種核酸適配體可以全面準(zhǔn)確地識(shí)別液體活檢的檢測(cè)靶標(biāo)；其次，核酸適配體的合成具有較低的批量變異性，可以方便地制備成多價(jià)納米組裝體，具有官能團(tuán)和小分子的位點(diǎn)特異性修飾允許高度定向和高密集的界面功能化，這些優(yōu)點(diǎn)都有助于高親和力捕獲界面的設(shè)計(jì)［19］。隨著材料科學(xué)和微/納米技術(shù)的發(fā)展，迄今為止，許多微/納米材料和微/納米工程裝置已經(jīng)被制造出來(lái)，為液體檢測(cè)提供了多功能、穩(wěn)健和高效的分離平臺(tái)，將核酸適配體整合到各種平臺(tái)中（包括磁性材料、微/納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)和微流控芯片）可以整合核酸適配體和平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)。

3.3 核酸適配體具有信號(hào)放大的優(yōu)勢(shì) 檢測(cè)靶標(biāo)的靈敏性分析對(duì)于準(zhǔn)確和可靠的疾病診斷很重要，但是體液中某些類型的檢測(cè)靶標(biāo)濃度較低，因此檢測(cè)靶標(biāo)的靈敏檢測(cè)需要信號(hào)放大策略，與其他識(shí)別配體相比，核酸適配體具有眾多獨(dú)特的組成和結(jié)構(gòu)特征，在信號(hào)放大方面有優(yōu)勢(shì)［9］，核酸適配體探針含有不同的信號(hào)放大基團(tuán)，它與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)提供多種直接放大策略，包括DNA 擴(kuò)增/組裝和酶催化反應(yīng)，或者對(duì)于與觸發(fā)序列雜交的核酸適配體探針，核酸適配體-靶標(biāo)相互作用競(jìng)爭(zhēng)性地釋放觸發(fā)序列以進(jìn)行信號(hào)放大，基于核酸適配體的信號(hào)放大策略有直接放大和競(jìng)爭(zhēng)放大。

4 展望

核酸適配體用于液體活檢具有的諸多優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用潛力，但是目前大多數(shù)核酸適配體的特性尚未得到充分研究，只有極少數(shù)核酸適配體被批準(zhǔn)用于臨床。全面的液體活檢仍需要靶向各種檢測(cè)靶標(biāo)的多種核酸適配體。此外，在復(fù)雜的基質(zhì)中，核酸適配體結(jié)合性能的降低使得基于核酸適配體的液體活檢變得困難，迄今為止，已有多種策略來(lái)提高核酸適配體的穩(wěn)定性和親和力，如對(duì)核酸酶敏感位置的核酸適配體序列進(jìn)行化學(xué)修飾和多價(jià)組裝，然而這兩種方法都使核酸適配體的應(yīng)用復(fù)雜化，并且化學(xué)修飾有時(shí)會(huì)影響核酸適配體的特異性和親和力，因此核酸適配體的多樣性、親和性以及穩(wěn)定性有望進(jìn)一步提高，需要更先進(jìn)的SELEX 技術(shù)。其次，CTCs 和外泌體攜帶著豐富的生物信息，這些生物信息是現(xiàn)有基于核酸適配體的液體活檢難以獲得的，由于CTCs 和外泌體高度的異質(zhì)性，它們不同的亞群與腫瘤的轉(zhuǎn)移有不同的相關(guān)性，但是基于核酸適配體親和力的分離依賴于特定生物標(biāo)志物的表達(dá)，這會(huì)導(dǎo)致CTCs 和外泌體的特定亞群檢測(cè)不出來(lái)，從而無(wú)法提供準(zhǔn)確和全面的信息，影響了腫瘤液體活檢的臨床價(jià)值。再次，標(biāo)準(zhǔn)化的處理程序和集成設(shè)備是臨床轉(zhuǎn)化的重要前提，借助商業(yè)儀器和試劑盒以及成熟方案，這些基于核酸適配體的腫瘤液體活檢方法將實(shí)現(xiàn)從工作臺(tái)到床邊的平穩(wěn)過(guò)渡。最好，具有質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化操作程序的商業(yè)試劑盒將確?；诤怂徇m配體的液體活檢方法可靠和并具有重復(fù)性。

綜上所述，通過(guò)核酸適配體特性的改善、檢測(cè)靶標(biāo)的綜合分析策略和相應(yīng)的商用設(shè)備的開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用可行性驗(yàn)證等方面的共同努力，基于核酸適配體的液體活檢有望推動(dòng)腫瘤診療的發(fā)展。