由佳，李明舉，許海軍，郭龍宗，李玉燕，戚卿業(yè)

(1.煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東 煙臺(tái) 264001；2.煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 煙臺(tái) 264003；3.山東益生畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265508；4.諸城外貿(mào)有限責(zé)任公司，山東 淮坊 262200)

雞大腸桿菌病(colibacillosis) 是由雞源致病性大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)引起的細(xì)菌性傳染病。大腸桿菌的多種毒力因子共同決定著細(xì)菌的致病性，在宿主受到大腸桿菌的侵襲進(jìn)而引發(fā)疾病的過(guò)程中，這些毒力因子共同作用，互相協(xié)調(diào)。目前，已知的主要毒力基因有：鐵離子獲得系統(tǒng)(耶爾森菌毒力島、氣桿菌素)、黏附素、溫度敏感血凝素、血清抗性蛋白、腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島、毒素、ColV 和ColBM 質(zhì)粒等。本試驗(yàn)通過(guò)PCR 方法對(duì)膠東地區(qū)肉雞大腸桿菌進(jìn)行毒力基因研究，以掌握肉雞大腸桿菌毒力基因的分布情況，為深入研究大腸桿菌致病機(jī)理、制定有效防控措施提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

膠東地區(qū)多家祖代和父母代肉種雞場(chǎng)、規(guī)?；唐啡怆u場(chǎng)疑似感染大腸桿菌的發(fā)病雞心臟、肝臟、脾臟、氣囊；祖代和父母代肉種雞場(chǎng)的死亡雞胚、1 日齡雛雞卵黃囊。從以上病料中分離到169 株大腸桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑(見表1)

1.1.3 主要儀器設(shè)備(見表2)

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 上已發(fā)表的毒力基因序列，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)出大腸桿菌13 種毒力相關(guān)基因的13 對(duì)特異性引物，如表3 所示，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2 模板制備

將大腸桿菌分離株接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，挑取數(shù)個(gè)單菌落，溶于1 mL 滅菌的生理鹽水中，搖勻制成細(xì)菌懸液，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清500 μL 至滅菌離心管中，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反應(yīng)體系及程序

PCR 反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix(含有2×Taq DNA 聚合酶、2×PCR Buffer 和2×dNTP)12.5 μL，10 pmol/μL 的上下游引物各0.5 μL，7.5 μL 的ddH2O，4 μL的模板。

PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入PCR 循環(huán)，94 ℃變性30 s，Tm 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離株毒力基因的PCR 結(jié)果

用PCR 法對(duì)分離得到的169 株大腸桿菌分離株檢測(cè)13 種毒力基因，共檢出12 種毒力基因，僅hlyA毒力基因未檢出，部分陽(yáng)性菌株P(guān)CR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1 至圖12。colBM、FimC、iucD、iss、FimA、iutA、fyuA、colV、tsh、irp2、iucA和papC12種毒力基因的檢出率分別為100%、100%、86.98 %、86.39 %、79.88 %、68.05 %、58.58%、50.89%、46.75%、38.46%、36.09%和11.83%。其中colBM、FimC兩個(gè)基因的陽(yáng)性檢出率均為100%，papC基因的檢出率最低，為11.83%，其余10 種毒力基因的檢出率在86.98%～36.09%。見圖13 和表4 。

圖1 10 株分離株FimA 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖2 10 株分離株colBM 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖3 10 株分離株iutA 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖4 10 株分離株fyuA 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖5 10 株分離株irp2 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖6 10 株分離株iucA 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖7 10 株分離株iss 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖8 10 株分離株FimC 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖9 10 株分離株tsh 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖10 10 株分離株488 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖11 10 株分離株papC 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖12 10 株分離株colV 基因產(chǎn)物電泳圖

3 討論

3.1 大腸桿菌毒力基因的分布

不同動(dòng)物源性的大腸桿菌的毒力基因數(shù)量眾多，且分布復(fù)雜。本試驗(yàn)參考大量文獻(xiàn)資料，最終選擇了在雞源性致病性大腸桿菌中檢出率較高并具有研究意義的13 種毒力基因，并對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)。1992—2011 年，王利勤(2012)[1]對(duì)從在陜西、河南、河北等六省相關(guān)雞場(chǎng)雞群中分離的320 株雞源性致病性大腸桿菌分離株進(jìn)行了毒力基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)colBM(100%)檢出率最高，hlyA(0.6%)最低，其他毒力基因及其菌株的檢出率由高到低為FimC、fyuA、iucD、iutA、colV、FimA、irp2、tsh、iss、iucA和papC，分別為89.4%、77.8%、73.8%、70.3%、66.9%、64.7%、66.6%、61.8%、55.6%、53.1%和20%。鄭志明[2]對(duì)195 株禽致病性大腸桿菌分離株中的13 種毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)毒力基因fimC、iucD、iss、tsh、irp2 和fyuA分別為93.8%、71.8%、60.0%、50.8%、45.1%、45.1%的檢出率在40%以上，papC和hlyE毒力基因的檢出率分別僅為7.2%和4.1%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，從膠東地區(qū)169 株肉雞源性大腸桿菌分離株中共檢出12 種毒力基因，僅hlyA基因未檢出，與王利勤的研究中hlyA基因0.6%的檢出率和鄭志明的研究中hlyE基因4.1%的低檢出率略有相似；colBM基因的檢出率為100%，與王利勤的研究結(jié)果相同；在王利勤和鄭志明的研究中FimC基因檢出率位居前列，本試驗(yàn)對(duì)FimC基因的檢出率為100%，比王利勤和鄭志明的研究結(jié)果偏高；本試驗(yàn)papC基因的低檢出率(11.83%) 與王利勤和鄭志明的研究結(jié)果基本相似；此外，iucD、FimA和iss分別為86.98%、79.88%、86.39%的檢出率略高于王利勤的研究結(jié)果，iutA、fyuA、irp2、iucA、tsh和colV分別為68.05 %、58.58%、38.46%、36.09%、46.75%、50.89%的檢出率略低于王利勤的檢出結(jié)果，但與鄭志明的研究結(jié)果差別不大。

3.2 不同毒力基因的檢出情況

本試驗(yàn)共檢測(cè)大腸桿菌的黏附素、鐵離子獲得系統(tǒng)(耶爾森菌毒力島、氣桿菌素)、血清抗性蛋白、大腸桿菌素、溶血素等13 種毒力基因，不同毒力基因在分離株中的檢出率各不相同。金文杰[3]對(duì)216 株禽源性致病性大腸桿菌分離株的研究顯示，黏附素FimC基因的檢出率為93.5%，papC基因的檢出率僅為6.5%，本試驗(yàn)顯示，F(xiàn)imC和FimA兩個(gè)毒力基因的檢出率分別為100%、79.88%，遠(yuǎn)高于papC基因的檢出率11.83%。這與金文杰的研究結(jié)果基本相同，說(shuō)明了黏附素I 菌毛的FimC和FimA基因比P 菌毛的papC基因在雞源性大腸桿菌中的存在更為廣泛；耶爾森強(qiáng)毒力島(HPI)fyuA和irp2 基因是大腸桿菌的重要毒力基因，可以作為檢測(cè)耶爾林強(qiáng)毒力島的標(biāo)志[4]，金文杰等[5]發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)分離的禽致病性大腸桿菌中，fyuA+irp2 基因的檢出率為44.9%，Oh 等[6]報(bào)道，在韓國(guó)雞源性大腸桿菌中，fyuA和irp2 基因的檢出率分別為32.8%和27.6%。在本試驗(yàn)所用的169 株分離菌中，fyuA+irp2 強(qiáng)毒力島基因組合的檢出率為63.31%，fyuA和irp2 基因的檢出率分別為58.58%和38.46%，均比上述研究結(jié)果偏高；ColBM 質(zhì)粒和ColV 質(zhì)粒具有相似的毒力基因，推測(cè)ColV 質(zhì)粒的演變產(chǎn)物可能為ColBM 質(zhì)粒[7]，本試驗(yàn)中攜帶大腸桿菌毒力相似的兩個(gè)基因colBM(100%)和colV(50.89%) 的檢出率差異較大，這與王利勤的研究結(jié)果相似，檢出率差異如此之大有待進(jìn)一步研究；溶血素hlyA基因在雞源大腸桿菌中的檢出率極低，其是對(duì)人類具有較強(qiáng)侵襲力[8]的腸產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌中的主要毒力因子，本試驗(yàn)在分離到的肉雞大腸桿菌菌株中未檢出該毒力基因，表明膠東地區(qū)肉雞大腸桿菌分離株存在極低或不存在人畜共患的安全隱患。