黃婷，譚磊，何玉榆，陳彤，丁燕玲，鐘名琴*

(1.深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點實驗室，廣東 深圳 518000)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GCS) 又名“腎上腺皮質(zhì)激素”，具有調(diào)節(jié)人體三大物質(zhì)(糖、蛋白質(zhì)、脂肪)代謝的生理作用，還能調(diào)節(jié)鉀、鈉和水的代謝，用來維持機體內(nèi)外環(huán)境的平衡，是機體應(yīng)激反應(yīng)最主要的調(diào)節(jié)激素，也是臨床上最常用和有效的抗炎、免疫抑制劑[1]。常見的糖皮質(zhì)激素類藥物主要是地塞米松、倍他米松，若人長期使用可能會出現(xiàn)不良反應(yīng)，還可能會降低機體免疫力，人類食用后可導(dǎo)致機體代謝紊亂和發(fā)育異常，或潛在致癌、致畸風(fēng)險[2]。目前，糖皮質(zhì)激素常被用于治療家畜的炎癥反應(yīng)、免疫性疾病、牛的酮病等，屬于生產(chǎn)常用的藥物。糖皮質(zhì)激素的非法用途是為了增加家畜的采食量，從而達到增重的目的。因此，世界各國都制定了對于動物源性食品中各種激素的最大殘留量，歐盟第96/22/EC 指令、美國食品與藥品管理局、日本政府都禁止在食品源性動物中使用激素類藥物[3]。我國GB31650-2019 《食品安全國家標(biāo)準食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，豬肉中地塞米松的最大殘留量為1.0 μg/kg，倍他米松的最大殘留量為0.75 μg/kg[4]。

目前，測定動物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物殘留的方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法[5]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。其中，酶聯(lián)免疫法只能用于篩查，液相色譜法的檢測項目比較單一，靈敏度低，耗時長，選擇性和特異性差，已達不到用于痕量獸藥殘留分析的要求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種分析動物源性食品中痕量獸藥殘留的重要方法，具有靈敏度高、選擇性和特異性好的特點，對低濃度樣本有很好的檢測率，還可用于測定不同基質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素類藥物。針對動物源性食品，常用標(biāo)準的前處理過程耗時長[6]，經(jīng)濟成本高，過程繁瑣，不能滿足目前對動物源性食品的高效、快速檢測的需求。為加強對動物源性食品獸藥的監(jiān)控，有效監(jiān)督我國獸藥濫用質(zhì)量現(xiàn)狀，我們對糖皮質(zhì)激素類藥物中的地塞米松、倍他米松進行檢測，前處理過程操作簡單，耗時短，有機溶劑用量少，成本低，還能將兩物質(zhì)進行分離，且結(jié)果可靠，靈敏度高，檢出限低。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

取適量新鮮豬肉組織，將其充分絞碎且均質(zhì)，-20 ℃避光保存。

1.2 儀器

TQ-XS 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters 公司)、多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司)、電子天平(感量0.01 g、感量0.000 1 g) [ 梅特勒托利多(Mettler Toledo) 集團]、3K15冷凍離心機[ 適馬(Sigma)股份有限公司]、Millipor 超純水儀、奧特賽斯AS 系列超聲波清洗機、OAN-EVAP 24 型可控溫的氮吹濃縮儀。

1.3 主要試劑與耗材

1.3.1 實驗室用水

符合GB/T 6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。

1.3.2 試劑

甲醇(CH3OH)、乙腈(C2H3N)、甲酸(HCOOH)為色譜純，購自德國默克公司。

1.3.3 乙腈水提取溶液

乙腈水提取溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸。

甲醇水復(fù)溶液甲醇+水+甲酸（10 ∶90 ∶0.09，V/V/V）。

Waters PRIME HLB(6 cc，200 mg)固相萃取柱(美國沃特世公司)；

濾膜(津騰，0.22 μm，水系)；

標(biāo)準物質(zhì)：地塞米松、倍他米松(純度＞98%，購自德國DR 公司)。

1.4 標(biāo)液配制

準確稱適量的地塞米松、倍他米松的標(biāo)準品，用甲醇分別配成100 μg/mL 的標(biāo)準儲備液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6 個月；分別移取適量地塞米松、倍他米松標(biāo)準儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當(dāng)濃度的地塞米松、倍他米松標(biāo)準工作液，置于-18 ℃冰箱中保存。

1.5 樣本前處理

準確稱取試樣2.00 g 于50.00 mL 離心管內(nèi)，加入10.00 mL 乙腈水提取溶液，震蕩搖勻30 s，超聲波清洗儀超聲5 min，于高速離心機8 000 r/min 離心5 min，備用。

于上述離心后提取液中移取4.00 mL 上清液過Waters PRIME HLB 固相萃取柱，保持1 滴/s 的速度。移出2.50 mL 至15 mL帶刻度的離心管中。流出液在40 ℃水浴下氮氣吹至少于0.50 mL。殘留液用甲醇水復(fù)溶液定容至1.00 mL，震蕩2 min，過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 液相色譜條件

a)色譜柱：BEH C18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)(美國Waters 公司)；

b)流速：0.30 mL/min；

c)柱溫：40 ℃；

d)進樣量：2.00 μL；

e)流動相及梯度洗脫程序(表1)。

1.6.2 質(zhì)譜參考條件(表2、圖1、圖2)

a) 離子源：電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)；

b)掃描方式：負離子掃描；

c)檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；

d)毛細管電壓：1.00 kV；

e)離子源溫度(TEM)：550 ℃；

f)去溶劑氣體流量：氮氣，1 000 L/h；

g)碰撞氣：氬氣。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準曲線

按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，量取適量糖皮質(zhì)激素類藥物標(biāo)準溶液，將其用空白基質(zhì)溶液制備成濃度為0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL 的混合系列標(biāo)準工作溶液進行上機測定，繪制標(biāo)準曲線[7]，測得地塞米松的相關(guān)系數(shù)為0.999 2，倍他米松的相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

圖1 陰性樣本添加0.50 ng/mL 地塞米松離子通道色譜圖

圖2 陰性樣本添加0.50 ng/mL 倍他米松離子通道色譜圖

2.2 方法檢出限測定(表3)

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，添加濃度為0.50 μg/kg，按照“1.5 樣本前處理”中介紹的試驗方法處理和測定，平行樣本7 個(n=7)，根據(jù)各樣本檢測值計算出平均值及標(biāo)準偏差。再根據(jù)公式檢出限MDL=(k×Sb×C)/X(式中：k 為置信因子，一般取3)，測定地塞米松、倍他米松檢出限分別為0.046 4 μg/kg 和0.047 3 μg/kg。

2.3 回收率及精密度確定(表4)

用空白豬肉樣本進行0.50、1.00 和5.00 μg/kg，3 個水平陽性添加回收實驗，每個水平取6 個平行樣，按“1.6.2 質(zhì)譜參考條件”處理和測定。地塞米松、倍他米松平均回收率和相對標(biāo)準偏差結(jié)果見表1。3 個水平的陽性添加回收率為76.2%～100.4%，相對標(biāo)準偏差為1.5%～4.8%。

3 結(jié)論

本試驗建立了一種檢測動物源性食品中糖皮質(zhì)激素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法。結(jié)果表明，該方法解決了現(xiàn)行檢測方法定性定量過程繁瑣復(fù)雜、耗時長的問題，節(jié)省了人力、物力和財力，具有前處理過程簡單、溶劑使用量少、穩(wěn)定性好、定量準確等優(yōu)點[8]，能滿足對動物源性食品糖皮質(zhì)激素類藥物進行快速定性定量檢測的要求，為獸藥殘留防控監(jiān)管提供強有力的技術(shù)支撐。