陳怡鑫，徐亞幸，黃東俊

(廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303)

“Clone”這一詞源自于希臘，原指用幼苗或枝條以無性繁殖的方式進行扦插，即通過無性繁殖方式由單個細(xì)胞或個體得到基因型與供體完全相同的新個體。動物克隆是近年來生物學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注的一門生物學(xué)高新技術(shù)，是指由一個動物的細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖而產(chǎn)生的遺傳上與細(xì)胞核的供體相同的動物個體[1]；該技術(shù)是一門涉及細(xì)胞工程學(xué)和胚胎工程學(xué)的生物技術(shù)[2]。最早的克隆動物是由1996—1997年基思·坎貝爾和伊恩·威爾穆特等使用羊的胚胎成纖維細(xì)胞和動物乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的克隆羊，克隆羊Dolly 的問世標(biāo)志著克隆動物的時代拉開了序幕。近年來，克隆牛、克隆山羊和克隆豬等克隆動物相繼問世[3]?？寺游镱I(lǐng)域不斷發(fā)展和進步，但是有關(guān)克隆動物的問題也隨之而來，如克隆動物技術(shù)問題、克隆動物食品安全問題、克隆動物制約問題等。本文對動物克隆技術(shù)中有待解決的問題、與克隆動物食品安全相關(guān)的問題、克隆動物相關(guān)制約問題等關(guān)鍵問題進行了較為系統(tǒng)的介紹，旨在闡明目前在動物克隆技術(shù)發(fā)展過程中所存在且未解決的問題，為進一步研究克隆動物提供研究方向的參考。

1 動物克隆技術(shù)的問題

1.1 克隆動物效率低

融合率是指不同基因型的原生質(zhì)體或細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞的融合成功率；胚胎發(fā)育率是指從受精卵形成到胚胎出離卵膜的成功率；產(chǎn)仔率指的是本年度內(nèi)出生仔畜累計數(shù)量對上年度終受胎母畜數(shù)的百分率。因此，克隆動物的總體效率可以通過以下的計算方式進行粗略的計算。

到目前為止，新聞報道過少數(shù)克隆動物具有較高的成功率，但是被公認(rèn)的克隆動物成功率僅有1%～3%，而克隆動物在胚胎移植后的出生率甚至不到10%[5]。目前來說，克隆動物研究獲得的最高效率的是Kato 等在研究克隆牛時獲得的，此次研究獲得的總效率為13.8%；但是，在隨后進行的有關(guān)克隆動物的研究中，他們獲得的總效率不到4%[6]。之所以會出現(xiàn)克隆動物總體效率較低的情況，是因為在克隆動物的過程中細(xì)胞核來源于高度分化的體細(xì)胞。在細(xì)胞分化的過程中，體細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)獲得了DNA 和染色質(zhì)的表觀修飾，促使細(xì)胞處于分化狀態(tài)。因為供體細(xì)胞的細(xì)胞核需要植入減數(shù)第二次分裂時期的卵母細(xì)胞進行克隆胚胎的發(fā)育，所以供體細(xì)胞的細(xì)胞核必須進行相應(yīng)的表觀遺傳修飾的重編程，激活與克隆胚胎早期發(fā)育有關(guān)的基因，促進有關(guān)基因的表達(dá)，并抑制與分化相關(guān)的基因的表達(dá)，從而獲得發(fā)育的全能性，產(chǎn)生克隆動物個體?？寺游锟傂实拖碌闹饕蚩赡苁枪w細(xì)胞細(xì)胞核的重編程不能完全進行，從而導(dǎo)致在克隆動物發(fā)育過程中存在部分起關(guān)鍵作用的基因沒有表達(dá)或表達(dá)異常[7]。

1.2 重構(gòu)胚胎植入后存活率低

重構(gòu)胚胎植入動物的子宮后，胚胎的流產(chǎn)現(xiàn)象較為嚴(yán)重[4]。楊向中等的研究表明，在7 日齡的重構(gòu)胚胎中，克隆動物重構(gòu)胚胎的基因表達(dá)已經(jīng)和供體細(xì)胞的基因表達(dá)存在較大的差別，且與人工授精產(chǎn)生的動物胚胎的基因表達(dá)極為相似，其相似的程度超過了人工授精胚胎和試管胚胎的相似程度。在楊向中等研究的有關(guān)動物胚胎的5 000 多個基因中，僅有不到50 個基因在克隆動物胚胎中的表達(dá)和在人工授精產(chǎn)生的胚胎中的表達(dá)出現(xiàn)了2 倍以上的區(qū)別；此項研究表明，克隆動物的重構(gòu)胚胎在克隆后經(jīng)過染色質(zhì)的重編程與正常胚胎的基因表達(dá)十分相近[8]?？寺游镏貥?gòu)胚胎植入存活率低可能是在后期的克隆動物重構(gòu)胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的。

張德福等認(rèn)為，克隆動物重構(gòu)胚胎在母體中流產(chǎn)可能是因為胎盤發(fā)育異常。胎盤是母體與胚胎進行氣體交換、營養(yǎng)輸入及代謝廢物交換的主要場所，除此基本作用之外，胎盤還會通過分泌與妊娠相關(guān)的激素、生長因子和胎兒免疫蛋白等物質(zhì)促進胚胎的發(fā)育。然而，克隆動物重構(gòu)胚胎常常出現(xiàn)胎盤異常肥大的現(xiàn)象，但是可用于母體和胚胎進行有效交換的部位卻有所減少，致使克隆動物胚胎在發(fā)育過程中胎盤功能異常，進而導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)。就克隆牛而言，在克隆牛胚胎從30～90 d 的發(fā)育過程中，胚胎的胎盤小體經(jīng)常發(fā)育異常，胎盤中的血管發(fā)育和胎盤子葉的數(shù)目會逐漸減少，并且胎盤上還具有一些血管化程度較低的尿囊和不正常的絨毛上皮[9]?？寺游镏貥?gòu)胚胎植入后存活率低的主要原因可能是因為胚胎的胎盤發(fā)育異常導(dǎo)致。

1.3 供體細(xì)胞的細(xì)胞核與受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)相互作用的協(xié)調(diào)性

供體細(xì)胞的細(xì)胞核與受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的相互協(xié)調(diào)與同步是影響細(xì)胞核重編程的關(guān)鍵因素之一，因此如果使受體細(xì)胞與供體細(xì)胞處于相同的細(xì)胞周期，克隆動物的成功率就會大大提高[10]?？寺⊙駾olly 之所以能夠產(chǎn)生，是因為伊恩·威爾穆特和基思·坎貝爾等找到了一種使供體細(xì)胞的細(xì)胞核和受體卵母細(xì)胞更為相容的方法，進而促使供體細(xì)胞核在DNA 復(fù)制時間上與受體卵母細(xì)胞基本同步，即處于同一時期。

目前認(rèn)為，受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)是處于減數(shù)第二次分裂期的卵母細(xì)胞，除了DNA 合成期外，其他各個時期的細(xì)胞均可作為細(xì)胞核的供體[11]。因為減數(shù)第二次分裂時期的卵母細(xì)胞內(nèi)含有的卵細(xì)胞促進成熟因子(maturationpromoting factor，MPF) 會導(dǎo)致處于DNA 合成期的細(xì)胞以及處于RNA 復(fù)制和有關(guān)蛋白質(zhì)合成時期的細(xì)胞發(fā)生早熟染色體凝聚和核膜破裂，然后經(jīng)過細(xì)胞核的重編程、DNA 復(fù)制和染色體倍數(shù)的增加，進而造成克隆動物重組細(xì)胞無法繼續(xù)正常發(fā)育[12]。

1.4 受體線粒體對克隆動物的影響

在動物細(xì)胞核移植重構(gòu)胚胎的過程中，供體核會連同自身細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)帶入受體細(xì)胞，導(dǎo)致克隆動物的線粒體成為雜合型，其既含有供體細(xì)胞所帶入的線粒體，也含有受體細(xì)胞質(zhì)本身所具有的線粒體，所以通過核移植產(chǎn)生的克隆動物重構(gòu)胚胎實際上是一種遺傳嵌合體[1]。

研究表明，隨著克隆動物重構(gòu)細(xì)胞的發(fā)育，受體細(xì)胞的線粒體可能存在以下三種情況。一是受體細(xì)胞的線粒體隨著克隆動物重構(gòu)細(xì)胞卵裂發(fā)育而逐漸減少，供體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的線粒體占主導(dǎo)地位。二是受體細(xì)胞的線粒體隨著克隆動物重構(gòu)細(xì)胞的卵裂發(fā)育而不斷增加，供體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的線粒體逐漸減少，最終受體細(xì)胞的線粒體占主導(dǎo)地位；三是供體細(xì)胞和受體細(xì)胞兩者的線粒體共存，兩者均未出現(xiàn)增多和減少[13]。

1.5 DNA 甲基化/去甲基化對克隆動物的影響

基因組遺傳修飾和基因組功能調(diào)節(jié)的主要方法是DNA 的甲基化。DNA 與蛋白質(zhì)的作用可以被基因組甲基化所改變，導(dǎo)致非編碼序列和發(fā)育相關(guān)基因處于隱性的可遺傳機制。細(xì)胞核重編程需要打破這種基因處于隱性的狀態(tài)，只有在供體細(xì)胞核移入后，重構(gòu)胚胎基因轉(zhuǎn)錄之前進行細(xì)胞核重編程，才能恢復(fù)受體細(xì)胞內(nèi)基因的活性[14]。

甲基化的DNA 會阻礙基因的正常表達(dá)，且甲基化的DNA 會被特殊的蛋白質(zhì)識別并穩(wěn)定結(jié)合，這些特殊的蛋白質(zhì)可以和轉(zhuǎn)錄共阻遏因子結(jié)合，導(dǎo)致核小體組蛋白的N 端的乙?；幻摮M而阻礙重構(gòu)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程。在克隆動物重構(gòu)胚胎發(fā)育的早期，DNA 開始甲基化，并且后續(xù)甲基化的水平會逐漸升高[15]。故想要成功地產(chǎn)生克隆動物，DNA 甲基化的可逆性研究是十分必要的。

1.6 克隆動物的端粒問題

端粒是染色體端部許多重復(fù)的短序列核苷酸所組成的具有高度保守性的特化部分。因為端粒無黏性，所以可以防止染色體黏著。細(xì)胞的遺傳物質(zhì)每復(fù)制一次，端粒的核苷酸數(shù)量就會減少并且縮短。端粒的自我復(fù)制要靠端粒酶，但是正常的細(xì)胞缺乏端粒修復(fù)酶，故端粒隨細(xì)胞分裂而變短，導(dǎo)致細(xì)胞分化程度較高后易衰老[3]。克隆羊Dolly 的染色體端粒較短，可能是Dolly 壽命較短的原因之一[16]。而影響染色體端粒長短的原因共有五種，第一種是由于物種不同所導(dǎo)致的端粒長度不同；第二種是培養(yǎng)代數(shù)較少的細(xì)胞染色體端粒較長；第三種是不同種類的細(xì)胞的染色體端粒長度不等；第四種是DNA 的重組機制導(dǎo)致端粒延長；第五種是表觀遺傳修飾對染色體端粒長度的影響[16]。

動物的染色體端粒分布較廣，而端粒長度是否關(guān)系到克隆動物的壽命，能否準(zhǔn)確地反映克隆動物的實際生理年齡，還需要進一步的證實[13]。

1.7 X 染色體失活問題

失活雌性動物的一條X 染色體可以實現(xiàn)雌、雄哺乳動物的基因劑量補償。正常情況下，未著床胚胎細(xì)胞的兩條X 染色體都能夠活動。后來，上胚層中X 染色體會隨機失活，而滋養(yǎng)層細(xì)胞則會失活父系的X 染色體[3]。死亡克隆動物胎盤的X 染色體會被隨機滅活，但是活體克隆動物的胎盤為父系X 染色體滅活。

1.8 克隆技術(shù)條件有待完善

克隆動物的研究已經(jīng)在技術(shù)優(yōu)化、理論基礎(chǔ)以及實際應(yīng)用等方面取得較大的發(fā)展，但是目前克隆動物的技術(shù)還不夠成熟，克隆動物機理性的相關(guān)理論研究水平也不夠高。要不斷完善動物克隆技術(shù)，還需要遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的支撐，以及在細(xì)胞核供體和卵細(xì)胞的選材、重組胚胎的激活方式、核質(zhì)比的選擇、是否需要進行連續(xù)核移植等技術(shù)方面均需進一步研究[17]。要提高動物克隆的成功率以及提高它們的存活率和延長其壽命還需科學(xué)家們不懈的努力，提升技術(shù)條件。

2 克隆動物帶來的食品安全問題

2.1 克隆動物食品的安全

歐洲食品安全局曾在2009 年9 月17 日聲明，克隆動物的肉、奶和它們后代所產(chǎn)的肉和奶在食品安全方面與普通家畜并無差異[18]。美國食品與藥品管理局也曾表明，危險評估主要集中于克隆動物自身，而不是有關(guān)克隆動物的食品以及有關(guān)克隆動物后代的食品。有文獻報道，認(rèn)為有關(guān)克隆動物的食品以及有關(guān)克隆動物后代的食品是不存在安全問題的[19]。但是目前為止，克隆動物尚未到達(dá)食用階段，更多的用于研究。

2.2 克隆動物食品的營養(yǎng)性

2.2.1 克隆動物食品——奶的營養(yǎng)性

動物的乳汁是一種富含營養(yǎng)的食品，含有很多人所需要的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)。與非克隆動物的乳汁相比，克隆動物所產(chǎn)的乳汁所含的蛋白質(zhì)和脂肪都有小幅度的減少，但是其蛋白質(zhì)和脂肪的含量依舊處于正常的范圍。如果就克隆動物個體之間的乳汁營養(yǎng)含量而言，蛋白質(zhì)和脂肪含量的變化幅度甚至小于非克隆動物[20]。

2.2.2 克隆動物食品——肉的營養(yǎng)性

科學(xué)家對克隆動物所產(chǎn)肉的營養(yǎng)性進行了一系列研究。研究表明，相對于非克隆動物所產(chǎn)的肉來說，克隆動物所產(chǎn)的肉含有更多的多不飽和脂肪酸，單不飽和脂肪酸的含量有所下降[20]。因為人體所需的脂肪酸多為多不飽和脂肪酸，所以從營養(yǎng)學(xué)的角度來看，克隆動物所產(chǎn)的肉可能更適合人食用。

2.3 有關(guān)克隆動物食品的法律

隨著克隆動物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)克隆動物的食品也逐漸流向市場，隨之出現(xiàn)的是有關(guān)克隆動物食品的流通問題。據(jù)此，學(xué)者賈晉杰提出幾條解決有關(guān)克隆動物食品流通問題的建議。第一是我國需要提升克隆動物食品生產(chǎn)的許可制度；第二是我國應(yīng)建立適度的克隆動物食品生產(chǎn)過程的操控系統(tǒng)；第三是建立克隆動物食品的溯源制度；第四是保護公眾知情權(quán)。讓公眾知曉自己所購買的是有關(guān)克隆動物的食品[21]。我國應(yīng)參考?xì)W美國家所持的“謹(jǐn)慎防御”的原則，建立我國較為完善的有關(guān)克隆動物食品的監(jiān)管部門和制度。不過到目前為止，克隆動物尚未到達(dá)食用的標(biāo)準(zhǔn)。

3 克隆動物的相關(guān)制約

3.1 克隆動物及其產(chǎn)品的專利性認(rèn)定問題

在認(rèn)定克隆動物及其產(chǎn)品的專利的過程中會出現(xiàn)一些無法避免的問題，而這些問題的解決方式有三種。一是專利的申請人請審查員或當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)檢測機構(gòu)前往產(chǎn)品處進行考查核實；二是提供專利申請人所產(chǎn)的有關(guān)克隆動物的基因組圖譜；三是保存繁殖的材料?？梢酝ㄟ^微生物的保存方式進行有關(guān)克隆動物的卵子、精子以及體細(xì)胞的保存。如果這些想法能夠得到有效的實施，那么有關(guān)克隆動物新種的保護問題將會被解決[22]。

3.2 有關(guān)克隆動物技術(shù)方面的規(guī)定

最早對克隆動物技術(shù)做出相應(yīng)的法律明文規(guī)定的國家是英國，例如使用克隆動物胚胎的相關(guān)研究需經(jīng)過英國行政機構(gòu)的認(rèn)可才能進行研究，并且禁止將克隆動物的胚胎植入人體內(nèi)，也禁止將人的胚胎植入動物體內(nèi)等[23]。

4 結(jié)語

盡管克隆動物的發(fā)展取得了較大的成就，但是由克隆動物引發(fā)的或克隆動物涉及的相關(guān)問題不能被忽視。在各國科學(xué)家的共同努力下，對克隆動物技術(shù)的研究會進入一個更高的水平，克隆動物食品能夠被廣大群眾所接受，與此同時克隆動物的技術(shù)必將能夠造福于人類社會，促進人類文明的進步。