方 堅， 阮 梅， 夏 磊， 黃 倩， 陳豐穗， 張志強(qiáng)， 張 霞， 賴彥華， 李 懿， 吳志賢， 周麗麗

肝移植術(shù)是部分肝癌患者及終末期肝病患者最佳治療選擇之一，我國每年肝移植數(shù)量達(dá)5 000余例[1]。得益于免疫抑制治療藥物的進(jìn)步等原因，患者肝移植術(shù)后的生存期顯著提升[2]。2015—2020年我國大陸公民逝世后器官捐獻(xiàn)肝移植受者術(shù)后1年、3年的累計生存率分別為83.6%、74.9%[3]。移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)是影響患者生存的主要原因之一[4]。我國大陸移植患者中，肝癌受者比例為36.8%[5]，而20%～57%的患者在術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[5-6]，中位生存期通常不足1年[2，7]。因此，尋找可靠的指標(biāo)評估肝癌患者移植術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素具有重要的價值。著絲粒蛋白L(centromere protein L,CENPL)是著絲粒蛋白家族的成員。著絲粒蛋白可結(jié)合紡錘體微管，細(xì)胞分裂時調(diào)控染色體分離[8]。CENPL的突變會影響著絲粒相關(guān)網(wǎng)絡(luò)蛋白的相互作用，從而阻礙著絲粒組裝和染色體排列[9]。本研究團(tuán)隊的前期研究發(fā)現(xiàn)，CENPL可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。然而，目前鮮有文獻(xiàn)報道CENPL在移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)中的作用。鑒此，本研究旨在探討肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)和復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2014年1月至2020年6月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院、聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院和廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院行肝移植術(shù)并在術(shù)后發(fā)生肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的患者93例(復(fù)發(fā)組)。經(jīng)性別與年齡匹配，選擇同期行肝移植手術(shù)但術(shù)后未復(fù)發(fā)的肝細(xì)胞癌患者46例(未復(fù)發(fā)組)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝移植術(shù)前經(jīng)病理檢查明確診斷為肝細(xì)胞癌；(2)年齡>18歲；(3)病歷資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他器官移植史者；(2)合并膽管細(xì)胞癌，或其他惡性腫瘤者；(3)隨訪依從性不佳者。

1.3肝移植方法 供體符合我國腦死亡捐贈規(guī)范[11]，手術(shù)方法均為原位肝移植。所有患者簽署知情同意書。肝癌肝移植的米蘭標(biāo)準(zhǔn)[12]：單個腫瘤直徑≤5 cm，或腫瘤數(shù)目≤3個，每個直徑≤3 cm，并且無大血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肝癌肝移植的杭州標(biāo)準(zhǔn)[11]：(1)無大血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移；(2)腫瘤直徑之和小于或等于8 cm，或腫瘤直徑之和大于8 cm，但滿足術(shù)前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)≤400 μg/L，且組織學(xué)分級為高、中分化。

1.4資料收集 通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者肝移植前的臨床資料，包括年齡、性別、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、肝硬化、Child-Pugh分級、白細(xì)胞(white blood cell,WBC)、血小板(platelet,PLT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽紅素(total bilirubin,TBil)、血細(xì)胞計數(shù)、腫瘤大小、腫瘤包膜、中國肝癌分期(China Liver Cancer Staging，CNLC)、AFP、免疫抑制劑方案、腫瘤復(fù)發(fā)時間、隨訪時間等。

1.5隨訪方法 隨訪間隔為1～3個月：對于術(shù)后早期指標(biāo)不穩(wěn)定的患者隨訪間隔為1個月；對于半年后狀態(tài)穩(wěn)定患者，隨訪間隔可延長至3個月。隨訪內(nèi)容包括生化檢查和影像學(xué)檢查?；灆z查內(nèi)容包括肝腎功能、電解質(zhì)、血脂、AFP水平及常見腫瘤指標(biāo)、血細(xì)胞分析、凝血功能、乙肝病毒DNA和乙肝五項，以及他克莫司、西羅莫司血藥濃度。影像學(xué)檢查包括腹部彩超、腹部或胸部CT或腹部MR。觀察患者肝癌復(fù)發(fā)情況，原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)診斷主要依據(jù)增強(qiáng)腹部和胸部CT或MR，并結(jié)合AFP水平，影像學(xué)報告均由有經(jīng)驗的高年資影像學(xué)?？漆t(yī)師出具。

1.6免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本來源于患者移植術(shù)前自身的病肝組織。常規(guī)二甲苯、酒精脫水。抗原修復(fù)：煮沸(95 ℃，15～20 min)，自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗罐子，加快冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)(pH 7.2)沖洗5 min，重復(fù)沖洗3次。阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3% H2O2室溫下孵育10 min，PBS(pH 7.2)沖洗5 min，重復(fù)沖洗3次。稀釋一抗，滴加50 μl稀釋好的一抗(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗5 min，重復(fù)沖洗3次。擦干后滴加30 μl聚合物增強(qiáng)劑(二抗試劑A)室溫25 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min，重復(fù)沖洗3次。加生物素化抗兔二抗室溫下孵育30 min，PBS沖洗5 min，重復(fù)沖洗3次。滴加100 μl新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液，顯微鏡下觀察5～20 min。自來水沖洗后，蘇木素復(fù)染，PBS液返藍(lán)。常規(guī)95%酒精脫水，干燥，封片。對染色程度進(jìn)行半定量評分。評分標(biāo)準(zhǔn)[13]：切片在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，根據(jù)染色細(xì)胞所占百分率評分。無明顯細(xì)胞著色為0分，1%～10%著色為1分，10%<著色≤30%為2分，>30%著色為3分。再根據(jù)染色強(qiáng)度評分：未顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。每張切片最終得分為染色百分率和染色強(qiáng)度平均分?jǐn)?shù)的乘積，得分≥3分者為高表達(dá)，得分<3分者為低表達(dá)[13]。免疫組化的一抗購自福州中杉金橋，二抗購自Abcam公司。

2 結(jié)果

2.1肝癌組織和癌旁組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 光鏡下可見癌組織CENPL染色呈陽性，主要表達(dá)在細(xì)胞核部位，少量在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。癌旁組織未見CENPL染色。見圖1。

?肝癌組織CENPL高表達(dá)；?癌旁組織CENPL表達(dá)不明顯圖1 肝癌組織和癌旁組織免疫組織化學(xué)染色所見(×200)

2.2兩組臨床資料比較 復(fù)發(fā)組CNLC為Ⅱ期、CENPL高表達(dá)的人數(shù)比例大于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其余指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.3肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的影響因素分析結(jié)果 以復(fù)發(fā)情況為因變量，將表1中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)(CNLC、CENPL表達(dá)情況)作為自變量納入多因素Cox回歸模型。結(jié)果顯示，以CNLC Ⅱ期為參照，CNLC Ⅰ期是肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的抑制因素[HR(95%CI)=0.46(0.13～0.91)，P=0.013]；以CENPL低表達(dá)為參照，CENPL高表達(dá)是肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的促進(jìn)因素[HR(95%CI)=1.68(1.41～2.99)，P=0.003]。

2.4肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存預(yù)后比較 CENPL高表達(dá)組的中位無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival,RFS)為5(3～22)個月，低表達(dá)組中位RFS為8(5～26)個月，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log-rank檢驗：χ2=9.269，P=0.002)。CENPL高表達(dá)組中位總生存期(overall survival,OS)為14(8～40)個月，低表達(dá)組中位OS為22(9～37)個月，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log-rank檢驗：χ2=4.406，P=0.031)。見圖2。

?兩組RFS比較；?兩組OS比較圖2 肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達(dá)組與低表達(dá)組生存預(yù)后情況的Kaplan-Meier生存曲線比較圖

2.5肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達(dá)組與低表達(dá)組臨床資料比較 兩組年齡、性別、HBV感染、HCV感染、肝功能、肝硬化、腫瘤包膜、大血管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達(dá)組與低表達(dá)組臨床資料比較

3 討論

3.1肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者在肝移植后的生存率下降。研究表明，肝移植后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的原因可能包括[14-17]:(1)移植前癌細(xì)胞已發(fā)生微轉(zhuǎn)移；(2)手術(shù)操作導(dǎo)致腫瘤破裂，從而引起腫瘤轉(zhuǎn)移；(3)免疫抑制劑的使用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。也有研究表明，腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境表達(dá)的多種生物分子在腫瘤的復(fù)發(fā)中發(fā)揮了重要作用[18]。術(shù)前檢測這些分子標(biāo)志物，術(shù)后定量檢測分泌性標(biāo)志物的相應(yīng)抗體，可預(yù)測肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)。但目前尚未有公認(rèn)和廣泛應(yīng)用的標(biāo)志物，因此進(jìn)一步尋找具有應(yīng)用價值的標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

3.2CENPL是著絲粒蛋白H-著絲粒蛋白I(centromere protein H-centromere protein I,CENPH-CENPI)相關(guān)的著絲粒復(fù)合體的一個亞基，是正常著絲粒功能和有絲分裂過程不可缺少的蛋白[19]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與CENPL相關(guān)的疾病包括染色體22Q11.2缺失綜合征、染色體17p13.3重復(fù)綜合征。目前關(guān)于CENPL在腫瘤中的研究報道較少。有文獻(xiàn)報道CENPL mRNA在肝細(xì)胞癌中過表達(dá)，其水平與患者的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)[10]。CENPL mRNA高表達(dá)者的生存預(yù)后情況較差。在沒有肝炎病毒感染的白種人和黃種人男性肝癌患者中，更高水平的CENPL mRNA與較差的OS相關(guān)。通過整合多個數(shù)據(jù)庫，Zeng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CENPL在多種癌癥類型中都呈高表達(dá)，且與不良臨床病理學(xué)特征顯著相關(guān)；基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CENPL可能通過細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、p53信號通路和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等途徑參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CENPL的表達(dá)與多種免疫細(xì)胞標(biāo)志物呈正相關(guān)，其中與M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulatory factors，IRF5)、Treg細(xì)胞標(biāo)志物趨化因子受體8(chemokine receptor 8，CCR8)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5B(signal transduction and activator of transcription 5B，STAT5B)的相關(guān)性最高。CENPL與T細(xì)胞衰竭標(biāo)志物也存在正相關(guān)，包括程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4)、淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG3)、胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率群盒蛋白(thymocyte selection-related high mobility group box protein，TOX)、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT)、重組人顆粒酶-B(recombinant human granzyme-B，GZMB)和T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，Tim-3)，特別是與Tim-3的相關(guān)性最高[21]。本研究免疫組化結(jié)果也顯示CENPL在肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，這與Feng等[22]的研究結(jié)果相似。也有研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌患者中，CENPL的表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫指標(biāo)呈正相關(guān)[23-24]。這解釋了CENPL高表達(dá)預(yù)測不良預(yù)后的結(jié)果，也為新的免疫治療方法提供了參考。

3.3目前關(guān)于CENPL在肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)中的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組的CENPL表達(dá)水平顯著高于未復(fù)發(fā)組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌復(fù)發(fā)患者中，CENPL高表達(dá)組的RFS、OS較低表達(dá)組更差，提示CENPL與肝移植術(shù)后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)有關(guān)聯(lián)。另外，高表達(dá)CENPL組發(fā)生血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的人數(shù)比例較低表達(dá)組更高，但結(jié)果未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與本研究病例數(shù)不足有關(guān)。近年來有一些研究者嘗試研究肝移植術(shù)后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的預(yù)測標(biāo)志物。王超[25]研究了供肝移植物單碳代謝基因多態(tài)性與肝移植后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)風(fēng)險之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單碳代謝基因多態(tài)性在肝移植后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)中具有重要作用，供體的rs1801394和rs1127717多態(tài)性可作為肝移植受者肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤內(nèi)肥大細(xì)胞(mast cells within the tumor，iMC)可能參與肝癌的抗腫瘤免疫作用[26]，其可預(yù)測移植后腫瘤復(fù)發(fā)。值得注意的是，對于超出了米蘭標(biāo)準(zhǔn)的患者，iMC可以識別低風(fēng)險患者；而在低AFP患者中，iMC可以識別高?；颊?。

綜上所述，CENPL表達(dá)與肝移植術(shù)后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)具有關(guān)聯(lián)性，高水平CENPL與患者不良預(yù)后有關(guān)。但本研究為回顧性研究，且樣本量較小，所得結(jié)論有待進(jìn)一步驗證。另外，CENPL為非分泌性蛋白，難以在血清中便捷檢測，故其在臨床中的應(yīng)用價值也有待開發(fā)，相關(guān)具體機(jī)制值得深入探索。