王 飛 趙文植 董章宏 馬路遙 李衛(wèi)英 李宗艷 辛培堯*

（1. 西南林業(yè)大學(xué)，國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)，西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

葉綠體在高等植物中廣泛存在，大部分物種有著母系遺傳特征的獨(dú)立基因組，即葉綠體基因組［1］。與核基因組相比，葉綠體基因組具有全長(zhǎng)序列短、易測(cè)序獲得、基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、保守性較高和進(jìn)化速率適中等優(yōu)勢(shì)，在植物系統(tǒng)發(fā)育分析、物種分類鑒定及分子標(biāo)記開發(fā)等研究中廣泛應(yīng)用［2-3］。例如對(duì)沙冬青屬（Ammopiptanthus）［4］、鵝耳櫪屬（Carpinus）［5］、苜蓿屬（Medicago）［6］、藜屬（Chenopodium）［7］等屬內(nèi)多個(gè)物種的葉綠體基因組特征進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確了各物種間親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育位置，為相關(guān)植物的分類鑒定及物種演化奠定了基礎(chǔ)?；谌~綠體基因組還可進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)，Alexander 等［8］利用焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）技術(shù)在紅槲櫟（Quercus rubra）葉綠體基因組中發(fā)掘出多個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，可用于該種質(zhì)資源的開發(fā)及鑒定。總之，葉綠體基因組在植物系統(tǒng)發(fā)育、物種演化等研究中意義重大。

絲蘭屬（Yucca）隸屬于天門冬科（Asparagaceae）龍舌蘭亞科（Agavoideae），約有40多種，主要分布在中美至北美的部分地區(qū)。絲蘭屬植物形態(tài)優(yōu)美，葉、莖纖維強(qiáng)韌，在園林觀賞和纜繩制作中應(yīng)用廣泛［9-10］。近年來(lái)，對(duì)絲蘭屬植物的研究主要集中在組培快繁［11］、理化指標(biāo)測(cè)定［12］、提取物在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用［13］以及該屬植物與絲蘭蛾（Tegeticula alba）互利共生關(guān)系［14］等方面，而有關(guān)葉綠體基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育的研究鮮見報(bào)道。相關(guān)報(bào)道僅見McKain 等［15］從絲蘭蛾傳粉時(shí)間和起源入手，完成了多種絲蘭屬及近緣屬植物的葉綠體基因組測(cè)序，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹首次從分子角度明確了龍舌蘭亞科各屬間的親緣關(guān)系。然而，關(guān)于絲蘭屬葉綠體基因組的種間變異情況、進(jìn)化機(jī)制及其各物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鮮見報(bào)道，相關(guān)研究亟待進(jìn)一步探究。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，多個(gè)物種的葉綠體基因組被測(cè)序并相繼公布。截至2022 年1月，NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定發(fā)表葉綠體全基因組的絲蘭屬植物有5種，分別是克雷塔羅絲蘭（Y.queretaroensis）、西地格絲蘭（Y. schidigera）、柔軟絲蘭（Y.filamentosa）、短葉絲蘭（Y.brevifolia）和Y.jaegeriana。為進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，探索絲蘭屬內(nèi)種間關(guān)系，利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得無(wú)刺龍舌蘭（Y. treculeana）葉綠體基因組序列，并與屬內(nèi)其他5個(gè)種的葉綠體基因組進(jìn)行比較，通過(guò)重復(fù)序列檢測(cè)、邊界收縮與擴(kuò)張分析、序列差異分析及核苷酸多態(tài)性分析等揭示絲蘭屬葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征和種間序列變異情況。基于葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹闡明6個(gè)種間的親緣關(guān)系，以期為絲蘭屬種間變異情況、進(jìn)化機(jī)制及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與數(shù)據(jù)收集

無(wú)刺龍舌蘭新鮮葉片采集于西雙版納熱帶植物園，放置于超低溫冰箱中-80 ℃保存，用于葉綠體基因組測(cè)序。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索絲蘭屬現(xiàn)已發(fā)表葉綠體全基因組的物種信息，下載各物種葉綠體基因組序列，記錄物種名及對(duì)應(yīng)的基因組登錄號(hào)。

1.2 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

選用無(wú)刺龍舌蘭新鮮嫩葉，利用改良CTAB法［16］提取基因組DNA。提取時(shí)在傳統(tǒng)CTAB 法的過(guò)程中，添加還原劑如β-巰基乙醇來(lái)避免褐化物質(zhì)對(duì)DNA 的影響，通過(guò)使用氯仿和水飽和酚反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)、多糖和次生代謝物等雜質(zhì)，進(jìn)而加強(qiáng)DNA 的沉淀效果。提取的DNA 分別使用紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 葉綠體基因組測(cè)序、組裝與注釋

利用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)［17］進(jìn)行高通量DNA 測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)GetOrganelle v1.7.5 軟件［18］組裝無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組，以近緣種克雷塔羅斯蘭（GenBank 號(hào)：KX931468）葉綠體基因組序列為參考，利用Geneous v8.1.3［19］和ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行注釋和修正。使用在線工具OGDRAW（https：//chlorobox. mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制葉綠體基因組結(jié)構(gòu)圖。無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組序列數(shù)據(jù)已上傳NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank號(hào)：OL912952）。

1.4 重復(fù)序列與SSR分析

利 用 在 線 軟 件REPuter（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）預(yù)測(cè)絲蘭屬葉綠體基因組內(nèi)散在重復(fù)，包括正向重復(fù)（F）、反向重復(fù)（R）、回文重復(fù)（P）、互補(bǔ)重復(fù)（C），具體參數(shù)設(shè)置如下：最短重復(fù)單元設(shè)為30 bp，漢明距離（Hamming distance）為3。串聯(lián)重復(fù)通過(guò)在線工具Tandem Repeats Finder（https：//tandem.bu.edu/trf/trf.html）進(jìn)行分析。絲蘭屬植物葉綠體基因組的SSR位點(diǎn)采用MISA 軟件（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)參數(shù)參考馬孟莉等［20］進(jìn)行設(shè)置，單核苷酸至六核苷酸單元重復(fù)數(shù)分別設(shè)為：≥10、≥5、≥4、≥3、≥3、≥3。

1.5 絲蘭屬植物葉綠體比較基因組分析

利 用 在 線 工 具IRscope（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）［21］繪制絲蘭屬植物葉綠體基因組四分體的邊界視圖，根據(jù)4個(gè)邊界上的基因差異分析其收縮與擴(kuò)張情況。以無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組序列為參照，在mVISTA（https：//genome.lbl.gov/vista/index.shtml）［22］分析程序下，用shuffle-LAGAN模式檢測(cè)絲蘭屬植物葉綠體基因組的序列變異情況。并基于葉綠體基因組序列（去掉1 個(gè)IR 區(qū)）比對(duì)結(jié)果，利用DnaSP 6［23］分析絲蘭屬植物葉綠體基因組的核酸變異情況，根據(jù)核苷酸多樣性指數(shù)（π）篩選高變異性位點(diǎn)，滑動(dòng)窗口長(zhǎng)度設(shè)為600 bp，步長(zhǎng)設(shè)為200 bp。

1.6 絲蘭屬植物系統(tǒng)發(fā)育分析

為了明確6 種絲蘭屬植物的系統(tǒng)發(fā)育位置及種間親緣關(guān)系，以龍舌蘭屬植物作為外類群，分別基于全葉綠體基因組和LSC+SSC 區(qū)，利用RAxML v8.2.12軟件［24］下的HPC2 on XSEDE 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值（Bootstrap value）設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲蘭屬葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與基因注釋

6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組均包括LSC、SSC、IRa 和IRb 4 個(gè)獨(dú)立的區(qū)域（見圖1）。絲蘭屬植物葉綠體基因組大小為156 185 bp（Y. schidigera）～158 020 bp（Y.jaegeriana），相差1 835 bp。除sghg 葉絲蘭的總GC 含量為37.9%之外，其余物種總GC 含量均為37.8%。從編碼基因數(shù)目來(lái)看，無(wú)刺龍舌蘭、柔軟絲蘭、克雷塔羅絲蘭、短葉絲蘭和Y.jaegeriana的基因總數(shù)相同，包括蛋白編碼基因（85）、tRNA（38）和rRNA（8）的數(shù)目完全一致（見表1）。與前5種植物相比，西地格絲蘭的葉綠體基因組缺失了1個(gè)蛋白編碼基因rpl32；6種絲蘭屬植物葉綠體基因組的tRNA 和rRNA 數(shù)目和類型均一致。絲蘭屬植物葉綠體基因組編碼基因主要由自我復(fù)制相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因、其他基因和ycf 類基因組成。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，絲蘭屬植物葉綠體編碼基因中有19 個(gè)基因存在雙拷貝，包括所有的rRNA，tRNA 基因trnN-GUU、trnR-ACG、trnA-UGC、trnI-GAU、trnV-GAC、trnL-CAA、trnI-CAU、trnH-GUG和 蛋 白 編 碼 基 因rps12、rps19、rps7、rpl2、rpl23、ndhB、ycf2。另外，在絲蘭屬植物葉綠體基因組中還存在trnK-UUU、trnG-GCC、trnL-UAA、trnV-UAC、trnA-UGC、trnI-GAU、rps16、rpl16、rpl2、rpoC1、ndhB、ndhA、atpF、petB、petD15 種含有2 個(gè)外顯子的編碼基因以及rps12、clpP、ycf33種含有3個(gè)外顯子的編碼基因（見表2）。

圖1 絲蘭屬葉綠體基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map of Yucca

表1 6種絲蘭屬植物葉綠體基因組基本結(jié)構(gòu)特征Table 1 Basic structural characteristics of the chloroplast genome of six Yucca species

表2 6種絲蘭屬植物葉綠體基因組基因類型Table 2 Chloroplast genome gene types of six Yucca species

2.2 重復(fù)序列與SSR分析

在6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組序列中分別檢測(cè)到不等數(shù)量的散在重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)，其中各物種的散在重復(fù)總數(shù)皆為49 個(gè)，除了短葉絲蘭無(wú)互補(bǔ)重復(fù)之外，其余5個(gè)絲蘭屬植物葉綠體基因組序列中均存在正向、回文、互補(bǔ)和反向4 種重復(fù)類型，且同類型重復(fù)數(shù)在各物種之間無(wú)明顯差異；而利用Tandem Repeats Finder 預(yù)測(cè)到的串聯(lián)重復(fù)在6 種絲蘭屬植物中均存在，數(shù)目為23～29 個(gè)（見圖2）。圖3顯示的是檢測(cè)到的SSR類型及序列信息，可以看出在絲蘭屬植物中SSR 類型主要以單核苷酸為主，其次是雙核苷酸和四核苷酸（見圖3A），統(tǒng)計(jì)絲蘭屬植物各核苷酸重復(fù)類型，發(fā)現(xiàn)單核苷酸的重復(fù)單元基本都是A/T，雙核苷酸的重復(fù)單元主要是AT，而四核苷酸的重復(fù)單元?jiǎng)t是以AAAT/ATTT為主（見圖3B）。

圖2 重復(fù)序列類型及數(shù)目Fig.2 Type and number of repeats

圖3 不同SSR單元及核苷酸重復(fù)序列Fig.3 Different SSR units and the nucleotide repeats

2.3 絲蘭屬葉綠體基因組邊界分析

葉綠體基因組進(jìn)化過(guò)程中，邊界會(huì)發(fā)生收縮與擴(kuò)張現(xiàn)象。6種絲蘭屬植物葉綠體基因組均為環(huán)形四分體結(jié)構(gòu)，存在LSC-IRb、IRb-SSC、SSC-IRa 和IRa-LSC 4個(gè)邊界?？赏ㄟ^(guò)比較邊界區(qū)域基因的類型和分布狀況來(lái)推斷物種在進(jìn)化過(guò)程中邊界的收縮與擴(kuò)張現(xiàn)象。絲蘭屬6 種植物葉綠體基因組邊界情況如圖4 所示，在LSC-IRb 邊界區(qū)域的基因?yàn)閞pl22和rps19，除了Y. jaegeriana的邊界位于rpl22基因內(nèi)，其他物種的邊界均是在這2個(gè)基因的間隔區(qū)；絲蘭屬植物的IRb-SSC邊界均位于ndhF基因左側(cè)，但Y.jaegeriana邊界距ndhF基因間隔42 bp，相差較大；6種絲蘭屬植物的SSC-IRa邊界均位于ycf1基因編碼區(qū)，但相比其他物種Y.jaegeriana的ycf1基因向IRa 區(qū)多擴(kuò)張了30 bp；Y.jaegeriana的IRa-LSC邊界在rps19基因編碼區(qū)內(nèi)，而其他絲蘭屬植物的IRa-LSC 邊界則位于rps19基因和psbA基因的間隔區(qū)。由此可以看出，絲蘭屬植物葉綠體基因組邊界在基因類型、收縮及擴(kuò)張的序列長(zhǎng)度等方面較為保守，但仍存在多樣性。Y. jaegeriana的4 個(gè)邊界相比其他物種均存在較大差異，可推測(cè)該物種的進(jìn)化速率較快或是較早的分化物種。

圖4 六種絲蘭屬植物葉綠體基因組四分體邊界比較LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC 4個(gè)邊界分別由JLB、JSB、JSA和JLA對(duì)應(yīng)標(biāo)注Fig.4 Comparisons of four regions boundary of chloroplast genomes in six Yucca species The four boundaries of LSC/IRb，IRb/SSC，SSC/IRa and IRa/LSC are marked by JLB，JSB，JSA and JLA，respectively

2.4 絲蘭屬葉綠體基因組差異

以無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組序列為參照，通過(guò)在線軟件mVISTA 對(duì)6 種絲蘭屬葉綠體基因組全長(zhǎng)序列差異進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖5。6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組的編碼區(qū)（exon）均具有較高的保守性，而非基因編碼區(qū)（CNS）差異較明顯，序列變異程度較高，這主要體現(xiàn)在LSC 區(qū)和SSC 區(qū)，而IRa 區(qū)基本不存在變異。西地格絲蘭在116 kb 處，即SSC 區(qū)的rpl32、truL-UAG、ccsA、ndhD上及基因間隔區(qū)存在較大差異，且在113 kb 處的ndhF基因上也存在較大的序列變異，這可能主要與該物種的基因缺失有關(guān)。除此之外，各物種的序列變異位點(diǎn)排列基本一致。變異程度較高的區(qū)域基本都位于2 個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)內(nèi)，如psbKtrnS-GCU、rps4-trnF-GAA、rpl32-ccsA-ndhD等，這些高變異位點(diǎn)為絲蘭屬物種鑒定提供了新的分子標(biāo)記資源。

圖5 六種絲蘭屬植物葉綠體基因組全序列Fig.5 Full sequences alignment of chloroplast genomes of six Yucca species

結(jié)合上述序列差異分析，進(jìn)一步對(duì)6種絲蘭屬植物葉綠體基因組的高變異區(qū)進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)絲蘭屬植物葉綠體基因組中π≥0.008 的核酸高變異區(qū)域有3 個(gè)，其中2 個(gè)位于LSC 區(qū)，1 個(gè)位于SSC區(qū)，而IR 區(qū)序列核酸變異程度均處于較低水平。結(jié)合vMISTA 圖譜發(fā)現(xiàn)兩者分析結(jié)果基本一致，進(jìn)而根據(jù)核酸多態(tài)性π值確定了變異程度較高的3個(gè)基因間隔區(qū)位置，分別是psbK-psbl-trnS-GCU（7 861～9 771 bp）、rpl20-rps12（70 855～72 467 bp）和ccsA-ndhD（117 525～119 331 bp）（見圖6），這有助于后續(xù)絲蘭屬植物的分子標(biāo)記開發(fā)及分類鑒定。

圖6 六種絲蘭屬植物葉綠體基因組核酸多態(tài)性Fig.6 Nucleic acid polymorphisms in the chloroplast genome of six Yucca species

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)在線軟件MAFFT 7 比對(duì)6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組序列，以龍舌蘭屬植物龍舌蘭（Agave americana）和劍麻（Agave sisalana）作為外類群，用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，6 種絲蘭屬植物以100%的檢驗(yàn)值劃分為兩大組：Group Ⅰ和Group Ⅱ（見圖7）。無(wú)刺龍舌蘭、克雷塔羅絲蘭、西地格絲蘭和柔軟絲蘭為Group Ⅰ，其中無(wú)刺龍舌蘭和克雷塔羅絲蘭互為姊妹關(guān)系，其親緣關(guān)系最近，檢驗(yàn)值達(dá)86%；Group Ⅱ僅有短葉絲蘭和Y.jaegeriana。而Group Ⅰ又可進(jìn)一步將柔軟絲蘭單獨(dú)劃分為1 個(gè)小支，與其他3 個(gè)絲蘭屬物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 基于全葉綠體基因組構(gòu)建的絲蘭屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of Yucca constructed based on the whole chloroplast genome

3 討論

植物葉綠體基因組因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、進(jìn)化速率適中、易測(cè)序獲得等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、分類鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化等方面具有重大研究意義［25］。通過(guò)分析6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)各物種間基因結(jié)構(gòu)和序列大小相對(duì)保守，不存在大程度的變異，6種絲蘭屬植物葉綠體基因組均為典型的四分體結(jié)構(gòu)（1 個(gè)LSC 區(qū)、1 個(gè)SSC 區(qū)和2 個(gè)IR 區(qū)），且序列差異多集中于LSC 區(qū)和SSC區(qū)。各物種所注釋到的編碼基因種類和數(shù)目也基本一致，尤其是tRNA 和rRNA 完全一致，這符合多數(shù)近緣種間植物葉綠體基因組具有遺傳保守性及穩(wěn)定性的基本特征［26］。一般來(lái)講，陸生植物葉綠體基因組通常具有較高的保守性。因此，若某個(gè)物種葉綠體基因組序列中出現(xiàn)大片段連續(xù)堿基的插入或缺失而導(dǎo)致某一基因的獲得或丟失，這可能意味著該物種在某一時(shí)期發(fā)生過(guò)進(jìn)化事件［27］。在6種絲蘭屬植物中，西地格絲蘭葉綠體基因組的SSC區(qū)大小僅為16 635 bp，相比其他5種絲蘭屬植物存在較大差異，最大差異為1 767 bp。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，造成SSC 區(qū)大小差異的原因主要是寬葉絲蘭葉綠體基因組的SSC 區(qū)出現(xiàn)了2 個(gè)大片段的堿基序列缺失（缺失堿基序列大小分別為1 534、116 bp），進(jìn)而導(dǎo)致rpl32基因的丟失和ndhF基因的注釋不完全。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與第四紀(jì)晚期該物種的歷史擴(kuò)張有關(guān)。De La 等［28］在西地格絲蘭的遺傳數(shù)據(jù)分析和環(huán)境生態(tài)位模型（ENMs）研究中就提出該物種具有較高的遺傳多樣性，且遺傳變異隨緯度的增加而顯著減少，其研究結(jié)果支持西地格絲蘭在第四紀(jì)晚期向加利福尼亞西北部擴(kuò)張。植物在整個(gè)歷史擴(kuò)張過(guò)程中長(zhǎng)期受自然選擇壓力的影響，進(jìn)而可導(dǎo)致基因上的差異（插入、缺失及突變）。Ueda 等［29］在研究楊樹（Populus）葉綠體基因組時(shí)就發(fā)現(xiàn)了rpl32基因丟失事件，但隨后該丟失的基因又在核基因組中被鑒定出來(lái)，此現(xiàn)象被稱為基因轉(zhuǎn)移，是真核細(xì)胞進(jìn)化的重要過(guò)程。因此，rpl32和ndhF基因有望作為一種標(biāo)記資源用于研究西地格絲蘭乃至絲蘭屬的進(jìn)化與演化。

葉綠體基因組遺傳穩(wěn)定，進(jìn)化路線獨(dú)立，由此開發(fā)出來(lái)的SSR 標(biāo)記在植物遺傳多樣性分析、物種分類鑒定等研究中具有明顯的優(yōu)勢(shì)［30-31］。在6種絲蘭屬植物中檢測(cè)到數(shù)目最多的SSR 類型是以A/T堿基為主的單核苷酸重復(fù)，其次是雙核苷酸和四核苷酸，且其序列的堿基組成也均是A 和T，說(shuō)明絲蘭屬植物葉綠體SSR 偏好使用A 和T 堿基。重復(fù)序列在植物葉綠體基因組中普遍存在，可導(dǎo)致葉綠體基因組某片段重復(fù)、缺失及重排，進(jìn)而影響物種的進(jìn)化以及種內(nèi)基因的遺傳變異［32］。在6種絲蘭屬植物中發(fā)現(xiàn)的散在重復(fù)總數(shù)一致，且重復(fù)序列類型主要為正向重復(fù)和回文重復(fù)，但各物種間包括串聯(lián)重復(fù)在內(nèi)的各類型重復(fù)數(shù)目卻不一致，這說(shuō)明6種絲蘭屬植物的突變頻率存在一定差異。這一現(xiàn)象在梧桐屬（Firmiana）葉綠體基因組中同樣存在，從2種梧桐屬植物葉綠體基因組中鑒定出來(lái)的重復(fù)序列總數(shù)均為49 個(gè)，且正向重復(fù)和回文重復(fù)占85%以上，但各類型重復(fù)序列的數(shù)量卻不盡相同［33］。

IR 區(qū)在維持葉綠體基因組穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)研究表明，植物在進(jìn)化過(guò)程中IR 區(qū)常發(fā)生收縮或向單拷貝區(qū)擴(kuò)張的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異［34］。6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組邊界（LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa 和IRa/LSC）幾乎不存在變異，只有Y.jaegeriana的邊界相比其他物種向后擴(kuò)張了約30 bp，表明其在進(jìn)化過(guò)程中基因組結(jié)構(gòu)發(fā)生了變異，推測(cè)原因可能是該物種進(jìn)化速率較快或是較早分化。通過(guò)比對(duì)全葉綠體基因組發(fā)現(xiàn)，6種絲蘭屬植物基因編碼區(qū)均具有較高的保守性，而非基因編碼區(qū)差異較明顯，序列變異程度較高，這主要表現(xiàn)在LSC 區(qū)和SSC 區(qū)。蔣禮玲等［7］在藜屬植物葉綠體基因組核苷酸變異研究中也證明了這一點(diǎn)，說(shuō)明對(duì)大多數(shù)被子植物而言，LSC 和SSC 區(qū)相比IRs 區(qū)具有更高的變異性，而豐富的變異區(qū)更有助于物種的系統(tǒng)發(fā)育研究。

通過(guò)分析葉綠體基因組序列多樣性，進(jìn)而檢測(cè)基因變異情況，可初步確定各物種間的高度變異區(qū)或篩選出核苷酸多樣性較高的基因，用于開發(fā)新的DNA 條形碼，這對(duì)物種鑒定分類意義重大［2，35］。Cui 等［36］對(duì)比分析了6 種鼠尾草屬（Salvia）植物葉綠體基因組序列，發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)基因和4個(gè)基因間隔區(qū)可能是鼠尾草屬植物的特異條形碼。本研究在6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組中根據(jù)核酸多態(tài)性π≥0.008 確定的3 個(gè)高變區(qū)psbK-psbl-trnS-GCU（7 861～9 771 bp）、rpl20-rps12（70 855～72 467 bp）和ccsA-ndhD（117 525～119 331 bp）可作為候選分子標(biāo)記用于開發(fā)特異DNA 條形碼，以幫助絲蘭屬植物的分類鑒定。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，在絲蘭屬植物葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)的非基因編碼片段psbl-trnS和ccsA-ndhD因較高的序列變異性現(xiàn)已分別應(yīng)用于石豆蘭屬（Bulbophyllum）［37］和蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）［38］的物種鑒別及DNA 條形碼設(shè)計(jì)。

同屬植物葉綠體基因組雖表現(xiàn)出高度的保守性，但各物種間仍存在一定程度的變異，這些變異位點(diǎn)非常適用于研究近緣同屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［7］。通過(guò)比對(duì)分析6 種絲蘭屬植物葉綠體基因組的序列變異程度，發(fā)現(xiàn)其高變異位點(diǎn)主要集中在葉綠體基因組的LSC 區(qū)和SSC 區(qū)。分別將這2個(gè)區(qū)域序列單獨(dú)提取出來(lái)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖各分支結(jié)果與利用全基因組序列構(gòu)建的發(fā)育樹圖分類完全一致，且均具有較高的支持率。因此，在絲蘭屬植物中完全可以利用LSC+SSC 區(qū)豐富的核苷酸變異位點(diǎn)對(duì)該屬植物進(jìn)行精確分類。