蔡文艷,潘 悅,張琪偉,田 陽

（華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 上海市綠色化學(xué)與化工過程綠色化重點實驗室,上海 200062）

0 引 言

光熱療法(photothermal therapy,PTT)是利用具有高光-熱轉(zhuǎn)換效率的光敏劑在目標生物組織中聚集并吸收足夠的外部光能(多數(shù)為近紅外光)而產(chǎn)生人造局部高溫的效應(yīng)來殺死癌細胞等病變細胞的一種新型治療方法[1].與傳統(tǒng)的治療方法(如外科手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法等)相比,光熱療法具有很多固有的優(yōu)點.由于它的光熱效應(yīng)發(fā)揮取決于光敏劑和激光照射兩個因素,因此,具有很好的特異性、可控性、低毒性、低侵入性以及操作便利性等特點,而且對周圍的健康組織的損傷較小.此外,光熱效應(yīng)不依賴于氧氣的存在,因此,與光動力學(xué)療法(photodynamic therapy,PDT)相比,在乏氧腫瘤的治療中具有更大的優(yōu)勢.

近紅外光(near-infrared light,NIR Light)一般指波長介于700 nm ～3μm的光,由于其在生物組織中的散射和吸收作用較弱而具有比可見光更大的組織穿透深度[2-3],故被廣泛應(yīng)用于細胞、活體等生物樣本的分析檢測與診療[4-5].尤其是在光熱治療中,具有近紅外吸收是對光敏劑的一個重要考察指標.目前開發(fā)的大多數(shù)光敏劑是一些具有近紅外吸收的無機材料,包括一些過渡金屬[6]、貴金屬[7-8]以及硫化物[9-10]等的納米顆粒.這些材料具有較長的吸收波長、良好的光-熱轉(zhuǎn)換(photothermal conversion,PTC)效率以及優(yōu)良的光穩(wěn)定性等優(yōu)點,但因為生物降解困難而具有潛在的長期毒性.相對而言,有機小分子通常具有較好的生物相容性,且易于被代謝,故近年來越來越受到人們的重視.為了使有機分子的吸收波長紅移至近紅外,一般可以通過增加共軛鏈長和引入芳香基團等方法實現(xiàn).基于此策略,一系列有機光熱試劑被開發(fā),例如花菁類[11-12]、并吡咯類[13-14]、卟啉類[15-16]、共軛聚合物類[17-18]等.然而,這些共軛分子通常需要繁瑣耗時的有機合成過程,且分子本身的水溶性也較差,需要添加有機溶劑或者表面活性劑才能應(yīng)用于水相環(huán)境.因此,如何設(shè)計開發(fā)一種便捷、有效的制備方法,獲得具有良好的水溶性和較高光熱轉(zhuǎn)化效率的有機分子,一直是化學(xué)家們研究的熱點.

本文開發(fā)了一種非常便捷、有效的制備方法,從一種吸收波長在紫外區(qū)(小于400 nm)的商業(yè)化有機小分子二苯并四硫富瓦烯(dibenzotetrathiafulvalene,DBTTF)出發(fā),利用其與葫蘆脲 [8](cucurbit[8]uril,CB[8])大環(huán)之間的主-客體包結(jié)作用[19],通過簡單的一步研磨法,無須有機溶劑的參與,即可得到一種主-客體比例為1∶2的超分子三元組裝體((DBTTF)2CB[8],DC).其超分子材料在水溶液中的吸收波長超過了1 000 nm,在近紅外區(qū)的最大吸收波長為842 nm,是一種典型的近紅外吸收材料.在880 nm激光照射下,該材料的光熱轉(zhuǎn)化效率達到了18.7%.我們也將此超分子光熱試劑應(yīng)用在了腫瘤細胞的光熱消融實驗中,在近紅外激光照射條件下具有優(yōu)異的殺滅癌細胞的作用,展現(xiàn)出了較好的光熱治療應(yīng)用前景.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑:二苯并四硫富瓦烯購自Sigma-Aldrich (默克公司);葫蘆脲 [8] 購于上海麥克林生化科技有限公司.所有試劑均為分析純,直接使用,無須進一步提純.實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm).

儀器: 紫外-可見光分光光度計UH5300和熒光光譜儀F-4500 (日本Hitachi); 核磁共振波譜儀600 MHz和高分辨質(zhì)譜儀6800(德國Bruker).LWIRL808-5W-F激光器購于北京鐳志威光電技術(shù)有限公司;FLIR-E4紅外熱成像儀購于深圳市粵通儀表有限公司.TCS-SP8激光共聚焦顯微鏡購置于萊卡公司.

1.2 超分子有機光熱試劑的制備

將DBTTF(6.84 mg,0.022 mmol)、CB[8](15 mg,0.011 mmol)同 時 加 入 石 英 研 缽 中,研 磨5 min至固體混合均勻,然后向研缽內(nèi)滴加2滴蒸餾水,繼續(xù)研磨5 min至蒸餾水完全揮發(fā).在研磨期間,固體由黃色變?yōu)榫G色,最后變?yōu)樗{黑色粉末狀固體.

DC的核磁共振氫譜及質(zhì)譜表征結(jié)果.1H NMR(500 MHz,D2O)d7.68(s,8H),7.37(s,8H),5.69(d,J=15.3 Hz,16H),5.49(s,16H),4.15(s,16H).LC-MS:C76H64N32O16S8,[(DBTTF)2+CB[8]]2+/2,calcd.968.146 6,found:968.147 6.

1.3 光熱實驗

用移液槍量取50μL不同濃度的DC溶液至1 mL比色皿中,使用880 nm的近紅外激光在不同功率密度下照射DC溶液升溫至穩(wěn)定平臺,關(guān)閉近紅外激光使溶液自然冷卻.在此過程中使用紅外成像測溫儀實時記錄溶液的溫度變化,并按照如下公式計算光熱轉(zhuǎn)換效率[20]:

式(1)中:h表示傳熱系數(shù),A表示傳熱面積,hA可參照式(2)計算;Tmax表示最高穩(wěn)態(tài)溫度,TSurr是環(huán)境溫度;QDis表示被溶劑和石英樣品池吸收的光的散熱,可由式(4)計算得到;I是入射激光功率;A880是溶液在880 nm波長處的吸光度.

式(2)中:mD和cD分別表示純?nèi)軇?水)的質(zhì)量和熱容;τS可以參照式(3)來計算.

式(3)中:t表示時間;τS表示樣品體系的時間常數(shù);TRT表示冷卻期中的實時溫度.

式(4)中:Tmax(water)為照射水得到的最高溫度;τS(water)為根據(jù)式(3)得到的水的時間常數(shù).

1.4 細胞培養(yǎng)

HeLa細胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院.細胞在含有10%胎牛血清的DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)液中培養(yǎng),溫度為37℃,二氧化碳濃度為5%.

將HeLa細胞與DC的PBS(phosphate buffered saline)溶液(30μmol/L)在培養(yǎng) 皿 中 共 培 養(yǎng)12 h,用新鮮的培養(yǎng)基多次清洗至多余的DC溶液至完全洗凈,然后用880 nm的激光(0.6 W/cm2)照射5 min.接著用鈣黃綠素/碘化丙啶對細胞進行染色. 熒光圖像由激光共聚焦顯微鏡拍攝.

2 結(jié)果與討論

2.1 超分子自組裝體的結(jié)構(gòu)表征

如圖1(a)所示,按照上述實驗步驟中的說明,將黃色的DBTTF粉末與白色的CB[8]粉末在微量水分存在下研磨后,可以明顯觀察到固體顏色變深,最后變成藍黑色,表明研磨過程中物質(zhì)化合物可能發(fā)生了一種化學(xué)反應(yīng).將該藍黑色粉末溶于水后,可得到藍色溶液,這與研磨前的兩種物質(zhì)形成鮮明的對比.研磨前,DBTTF完全不溶于水,而CB[8]的水溶液則是無色透明液體.為了理解這一水溶性與顏色的變化機理,本文對DC的水溶液進行了吸收光譜的測試.如圖1(b)所示,兩個原料(DBTTF與CB[8])的吸收波長都在紫外區(qū),而DC的水溶液則在402 nm、596 nm、842 nm 3處產(chǎn)生了明顯的吸收峰.根據(jù)文獻報道,這是四硫富瓦烯類化合物典型的自由基陽離子二聚體狀態(tài)的吸收[21].該體系中自由基陽離子的產(chǎn)生,是由于研磨過程中空氣中的氧氣與DBTTF接觸并氧化造成,而自由基陽離子之所以能穩(wěn)定存在,是由于兩分子的DBTTF之間的π-π堆積以及分子間電荷轉(zhuǎn)移作用的存在[22],同時CB[8]大環(huán)空腔也提供了一個屏蔽的疏水空腔.因此,DBTTF的自由基陽離子可以在CB[8]空腔中配對堆疊并穩(wěn)定存在,形成了一種三元自組裝體(DBTTF)2CB[8],簡記為DC,如圖2(a).

圖1 DC的制備過程及其各組分的吸收光譜Fig.1 Preparation of DC and absorption spectra of DBTTF,CB[8],and DC

為了證明上述三元自組裝結(jié)構(gòu)的存在,我們對DC在氘代水溶劑中進行了核磁共振氫譜的表征.如圖2(b)所示,1H NMR中的各種質(zhì)子的積分面積表明,DBTTF和CB[8]之間的計量比為2∶1(水溶液中有部分自由狀態(tài)的CB[8]殘留,根據(jù)核磁積分結(jié)果,自組裝效率約為80%).為了進一步理解DBTTF與CB[8]之間的主-客體相互作用,開展了二維ROESY核磁的研究,如圖2(c)所示,可以明顯觀察到屬于DBTTF的b氫與屬于CB[8]大環(huán)的x氫之間具有nuclear Overhauser effects(NOE)信號[23-24],這表明這兩種氫在空間上具有相關(guān)性,而x氫是指向CB[8]大環(huán)分子空腔內(nèi)部的.因此,根據(jù)一維和二維核磁的結(jié)果,可以證明DBTTF與CB[8]之間是以2∶1的計量比形成了一種主-客體包結(jié)產(chǎn)物.此外,在正模式下,DC的高分辨質(zhì)譜圖譜中可以觀察到968.147 6的質(zhì)荷比,歸屬于[(DBTTF)2+CB[8]]2+/2的離子峰(圖2(d)),而且同位素峰值均相差0.5 D(道爾頓)左右,說明組裝體DC含有兩個單位正電荷,符合自由基陽離子二聚體的特征.這一結(jié)果與理論模擬質(zhì)譜圖的同位素峰吻合(圖2(e)).

圖2 超分子組裝體DC的自組裝機理示意圖及結(jié)構(gòu)表征Fig.2 Schematic of the self-assembly mechanism and structural characterization of DC

2.2 超分子組裝體的水溶液光熱性能測試

由于DC溶液在近紅外區(qū)有較強的吸收,我們進一步探究了它的光熱轉(zhuǎn)換性能.如圖3(a)所示,在0.9 W/cm2,880 nm的激光照射300 s后,DC水溶液的溫度從29.5℃上升到88.2℃,共升高58.7℃;對照組蒸餾水用相同功率密度的激光照射相同時間后,溫度僅上升了4.5℃.計算后得到DC水溶液的光熱轉(zhuǎn)換效率為18.7%,這表明該材料有著較好的光熱轉(zhuǎn)換能力.隨后測試了不同濃度和不同激光功率密度下DC水溶液的升溫曲線.從圖3(b)和3(c)可見,DC水溶液的溫度隨著濃度和激光功率密度的升高而升高,表明DC水溶液有著較好的濃度依賴性和功率依賴性.最后還測試了其3個升溫冷卻周期的溫度曲線圖.由圖3(d)可見,DC溶液的光熱轉(zhuǎn)換表現(xiàn)出良好的重復(fù)性,表明其在本實驗光照條件下有著良好的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性.

圖3 DC的光熱性能測試Fig.3 Photothermal measurements of DC

2.3 超分子光熱試劑在活細胞中的光熱治療性能驗證

在上述實驗的基礎(chǔ)上進一步探究DC是否具有在活細胞中進行光熱治療的性能.本文選擇HeLa細胞作為模型,在與DC孵育后用0.6 W/cm2,880 nm激光照射5 min,并用鈣黃綠素和碘化丙啶染色來檢測光熱消融的效果.如圖4所示,共聚焦熒光成像結(jié)果顯示,沒有光照下的DC組以及沒有DC孵育的激光組都沒有明顯的死亡細胞,表明單純的DC和本實驗光照條件本身并不能對細胞造成傷害,而DC+Laser組可以發(fā)現(xiàn)HeLa細胞基本上都已死亡.由上述實驗可知:DC在沒有輻射的情況下表現(xiàn)出較低的細胞毒性和較好的生物相容性;在光照激發(fā)下,可以迅速升溫殺死HeLa細胞,因此DC有著較好的光熱治療潛力.

圖4 細胞光熱實驗的共聚焦熒光成像圖Fig.4 Confocal fluorescence images from photothermal ablation experiments on HeLa cells

3 結(jié) 論

本文提出了一種非常簡單有效的有機超分子光熱材料的制備方法,基于DBTTF與CB[8]之間的超分子自組裝策略,通過簡單的一步研磨法可以得到一種具有近紅外吸收的三元超分子組裝體.該超分子中CB[8]大環(huán)穩(wěn)定了DBTTF的自由基陽離子對,其水溶液的吸收波長在近紅外處有一個較強的吸收峰(842 nm),且最長吸收波長超過了1 000 nm.在880 nm激光照射下,該材料具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能、光熱穩(wěn)定性和生物相容性,其光熱轉(zhuǎn)化率達到了18.7%.因此,在光熱治療、光熱轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值.