魏 迅, 江 霞, 鄭羽旋, 張樂文, 周正宇

(1.蘇州大學(xué)實驗動物中心,蘇州 215123; 2.深圳華大生命科學(xué)研究院,深圳 518083)

胰腺作為人體器官之一，位于左上腹的胃和腸道之間，結(jié)構(gòu)上分為外分泌腺和內(nèi)分泌腺。胰腺具有兩大功能，分別是消化和代謝。外分泌腺主要產(chǎn)生胰液，其中含有大量酶；內(nèi)分泌腺主要是4 種胰島細胞，負責(zé)分泌胰島素和胰高血糖素，以維持機體的血糖平衡。常見的胰腺疾病類型有胰腺炎、糖尿病和胰腺癌等。通過構(gòu)建有效的動物模型研究各種胰腺疾病，逐漸成為臨床機制研究和藥物開發(fā)的熱點［1］。

胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells，PSCs）是胰腺組織的基質(zhì)細胞，主要位于胰腺小葉間和腺泡周圍區(qū)，圍繞鄰近腺細胞基底部，約占胰腺細胞總數(shù)的4%～7%［2］。PSCs 在胰腺中有兩種形態(tài)：靜息狀態(tài)和活化狀態(tài)?；罨癄顟B(tài)下的PSCs具有很強的增殖和遷移能力，可促使胰腺纖維化，從而引發(fā)胰腺疾?。?］。目前，關(guān)于PSCs在胰腺疾病動物模型方面的研究報告較多，而在胰腺疾病臨床發(fā)生機制及治療應(yīng)用方面的研究相對較少。本文對胰腺疾病動物模型研究中PSCs發(fā)揮的作用做一綜述，探討PSCs影響胰腺疾病的可能機制，為今后預(yù)防和治療胰腺疾病的臨床研究提供新的思路。

1 PSCs

1998 年，德國科學(xué)家Bachem 等首次在人和大鼠的胰腺基質(zhì)中分離出能特異性表達Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖連蛋白等細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分的胰腺基質(zhì)細胞，由于它和肝臟中的肝臟星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）性質(zhì)十分相似，二者的細胞質(zhì)內(nèi)都富含能自發(fā)藍綠熒光的維生素A脂滴，故將其命名為PSCs［4］。PSCs在靜息狀態(tài)下，富含細胞質(zhì)維生素A 脂滴，可特異性表達神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白，具有較低水平的ECM 遷移能力［5］。長期飲酒和吸煙、胰腺組織壓力以及高血糖都會刺激靜息狀態(tài)的PSCs，使其產(chǎn)生一些有毒的代謝物和細胞因子，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進而轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)［6］?；罨癄顟B(tài)的PSCs特征表現(xiàn)為：細胞質(zhì)脂滴維生素A消失，ECM遷移能力提高，特異性表達α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA），并分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖連蛋白和其他ECM成分［7］。

為在胰腺疾病動物模型中探究PSCs作用的可能機制，需要提取原代PSCs。目前較為成熟的提取原代PSCs 的方法有兩種：一是用Ⅳ型膠原酶和鏈霉蛋白酶E 從膽總管逆行灌注消化，再利用碘海醇的溶解度梯度離心法分離［8］；二是利用組織塊培養(yǎng)法，體外無菌分離胰腺，剪碎成小塊，讓小塊的胰腺組織貼壁后加入含15%～20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，即可得到原代的PSCs［9］。

2 胰腺疾病動物模型

胰腺疾病常見有胰腺炎、糖尿病和胰腺癌等類型。目前，這幾種胰腺疾病的發(fā)病機制尚未研究清楚。建立有效的動物模型可用于研究胰腺疾病發(fā)生機制，以及開發(fā)治療藥物。以下簡單介紹用于PSCs作用機制研究的3種胰腺疾病相關(guān)的動物模型。

2.1 胰腺炎動物模型

急性胰腺炎（acute pancreatitis）是由多種因素導(dǎo)致胰腺出現(xiàn)水腫、壞死等局部炎性損傷的急腹癥之一。引起該病的常見原因主要是過量飲酒和膽石癥［10］。急性胰腺炎的發(fā)病率逐年增高，其總體死亡率約為5%［11］。目前，急性胰腺炎的發(fā)病機制尚未研究清楚，建立有效的動物模型可用于研究其發(fā)病機制和治療藥物。用于急性胰腺炎造模的實驗動物主要有大鼠、小鼠、負鼠、豚鼠、犬、貓、兔、豬、猴等［12］。

常用的急性胰腺炎動物模型是Toll樣受體4基因缺失小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，PSCs 在胰腺炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。乙醇、脂多糖等能被病原體相關(guān)模式分子識別受體如Toll 樣受體結(jié)合，激活免疫系統(tǒng)，同時也激活PSCs，釋放損傷相關(guān)模式分子等內(nèi)源性物質(zhì)，造成機體炎性因子水平升高和胰腺組織損傷［13］。活化的PSCs 還作用于促炎M1 型巨噬細胞和免疫調(diào)節(jié)M2型巨噬細胞。而巨噬細胞在急性和慢性胰腺炎中發(fā)揮著不同的潛在作用。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞與PSCs 緊密靠近；與M1 型巨噬細胞占主導(dǎo)地位的急性胰腺炎不同，小鼠和人類慢性胰腺炎中胰腺組織被M2 型巨噬細胞浸潤。此外，小鼠和人的PSCs 都是白細胞介素4 受體alpha（interleukin-4 receptor alpha，IL-4Rα）配體的來源，并且可促進M2 型巨噬細胞極化。M2型巨噬細胞反過來又能有效地激活PSCs，促進“前饋”過程，該過程提示巨噬細胞在胰腺纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。值得注意的是，在患有骨髓特異性IL-4Rα缺失的小鼠或在確診疾病后接受IL-4Rα藥物抑制劑治療的小鼠中，胰腺纖維化減少［14］，因此通過抑制M2 型巨噬細胞的激活來減少PSCs 的活化，可能降低慢性胰腺炎的發(fā)病率。

2.2 糖尿病動物模型

糖尿病（diabetes mellitus）是一個日益嚴重的公共衛(wèi)生健康問題，其類型主要有1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病等，其中2 型糖尿病占90%以上，給社會帶來沉重的醫(yī)療負擔(dān)［15］。因此，建立理想的糖尿病動物模型將為其發(fā)病機制研究、并發(fā)癥治療及臨床新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。目前，常用于構(gòu)建糖尿病模型的實驗動物有大鼠、小鼠和斑馬魚等［16］。

糖尿病模型OLETF大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，PSCs在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的主要作用與氧化應(yīng)激和纖維化相關(guān)。在糖尿病模型OLETF 大鼠中，β 細胞會因為胰島素分泌過程高耗氧而變得缺氧，尤其是在氧氣供應(yīng)不足時［17］，PSCs 在缺氧期間被激活，通過觸發(fā)腺泡細胞中異常的Ca2+信號，降低ATP 水平，引起腺泡壞死，誘導(dǎo)胰腺外分泌腺組織損傷；同時在胰島中觀察到α-SMA陽性的PSCs細胞數(shù)量增加，并通過細胞凋亡促進胰島β細胞死亡［18］。另外，PSCs被炎性細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）激活后，細胞內(nèi)壓力迅速升高，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）發(fā)生磷酸化，進一步促進TGF-β1 和膠原蛋白的分泌［19］。用絲裂原激活的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）和p38 MAPK 的拮抗劑可抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的α-SMA表達和細胞增殖，促進胰腺損傷和胰島β細胞凋亡，致使糖尿病癥狀加劇［19］。

2.3 胰腺癌動物模型

胰腺癌（pancreatic cancer）是惡性程度最高的癌癥之一，多發(fā)病于老年人群中。全球范圍內(nèi)每年有超過41.16 萬的胰腺癌患者，且其5 年生存率低于5%［20］。胰腺癌難以診斷，往往在疾病發(fā)展到晚期才被發(fā)現(xiàn)。目前，胰腺癌的致病原因尚不清楚。構(gòu)建胰腺癌動物模型是研究胰腺癌的有效方法。常見的胰腺癌動物模型構(gòu)建方法包括向免疫缺陷鼠體內(nèi)移植來源于患者的胰腺癌組織、化學(xué)誘導(dǎo)法如腹腔注射致癌物N-亞硝基雙胺。最近有研究發(fā)現(xiàn)，利用Cre-Lox技術(shù)，可針對小鼠胰腺中原癌基因Kras和抑癌基因Trp53的內(nèi)源等位基因進行突變，再通過不斷雜交繁育得到轉(zhuǎn)基因LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre（KPC）小鼠；KPC 小鼠是研究最多的胰腺導(dǎo)管癌基因工程小鼠模型之一［21-22］。

在原位胰腺癌模型小鼠中，活化的PSCs類似于癌癥相關(guān)成纖維細胞，通過改變胰腺基質(zhì)細胞的ECM以及分泌各種細胞因子和趨化因子發(fā)揮重要作用。胰腺癌的基質(zhì)主要由PSCs 沉積的膠原纖維以及其他細胞（如肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞）和非細胞（即ECM）組成，這些基質(zhì)成分可以介導(dǎo)PSCs與癌細胞之間的相互作用。PSCs 被激活后將產(chǎn)生大量的α-SMA 蛋白，改變了原有的胰腺基質(zhì)細胞和ECM，更適應(yīng)癌細胞的增殖和擴散［23］。活化的PSCs 還通過介導(dǎo)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的下游信號通路增加趨化因子CXCL12 受體表達，抑制細胞毒性T（CD8+T）細胞浸潤，從而使癌細胞發(fā)生免疫逃逸，最終影響胰腺癌的生物學(xué)行為和臨床結(jié)果［24］。

3 利用胰腺疾病動物模型開展的PSCs 機制研究

研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺疾病小鼠模型的胰腺病理組織及血清中都能檢測出ECM蛋白以及促炎性因子，且其水平明顯高于正常組織［3］。而PSCs經(jīng)過活化后具有很強的增殖和遷移能力，并且可以分泌大量ECM蛋白和促炎性因子，促進纖維化和炎性水平上升，改變了胰腺組織的微環(huán)境，最終導(dǎo)致胰腺疾病的發(fā)生［25］。為了更好地研究胰腺疾病的發(fā)生發(fā)展機制，有學(xué)者通過構(gòu)建胰腺疾病動物模型探討了PSCs對胰腺疾病發(fā)生發(fā)展的作用及其可能的機制。

3.1 PSCs與纖維化

纖維化可發(fā)生于多種器官，主要病理特征為器官組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實質(zhì)細胞減少，持續(xù)進展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴重威脅健康和生命。在TGF-β1 過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)小鼠具有慢性胰腺炎的組織形態(tài)學(xué)特征，如細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白積累［26］。在2 型糖尿病Goto-kakizaki 大鼠模型實驗后期，通過天狼星紅染色觀察到胰島纖維化；胰島纖維化在β 細胞衰竭的進展中發(fā)揮重要作用，因為它誘導(dǎo)β 細胞凋亡，從而導(dǎo)致分泌胰島素的功能進一步受損［27］。胰腺的纖維組織主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，PSCs是人類和實驗動物模型胰腺纖維化中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的主要來源，且會分泌大量炎性因子；同時TGF-β1 會促進大量ECM蛋白合成，纖維化水平不斷提高，最終引發(fā)2 型糖尿病和急性胰腺炎，甚至胰腺癌的癥狀［28］。目前，胰腺纖維化的發(fā)病機制尚未完全闡明，但其很可能來源于PSCs的激活，PSCs活化會導(dǎo)致大量的ECM產(chǎn)生，激活狀態(tài)的PSCs會快速增殖、遷移擴散，進而導(dǎo)致胰腺實質(zhì)細胞減少，胰腺外分泌腺和胰島呈纖維化狀態(tài)［29］。簡而言之，PSCs的激活會造成胰腺纖維化，胰腺纖維化會使胰腺功能喪失，甚至協(xié)助胰腺癌細胞擴散，從而加速胰腺疾病的發(fā)生發(fā)展。

3.2 PSCs與氧化應(yīng)激

在2 型糖尿病小鼠模型中，高血糖癥狀會提高氧化應(yīng)激水平，刺激PSCs 活化，加劇胰腺纖維化進程，并且伴隨著活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增高，胰腺纖維化水平也升高［30］。氧化應(yīng)激與癌癥、2型糖尿病及自身免疫性疾病的發(fā)生機制有關(guān)［31］。在正常小鼠模型中，氧化應(yīng)激會刺激PSCs的活化，從而分泌一些細胞因子和趨化因子，激活一氧化氮信號通路，導(dǎo)致急性胰腺炎等炎性疾病的發(fā)生；同時，這些活性分子可直接作用于DNA、蛋白質(zhì)、脂類，也可作為功能性分子信號，激活細胞內(nèi)多種應(yīng)激敏感信號通路，比如MAPK 信號通路，與PSCs 的增殖、遷移能力及胰島素抵抗和胰腺β 細胞功能受損密切相關(guān)［32］。從SD 大鼠分離出的原代PSCs 在缺氧條件下被激活，激活的PSCs 與胰島β 細胞共培養(yǎng)后，可以促進β 細胞凋亡［18］；激活的PSCs 還可以通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，間接抑制β細胞功能。β細胞受損后，胰島素分泌水平降低，分泌高峰延遲，血糖波動加劇，因而難以控制餐后血糖的迅速上升，對β 細胞造成更為顯著的損害［33］。PSCs 被認為在氧化應(yīng)激信號通路中起到傳感器的作用，通過至少兩個第二信使向下游發(fā)送壓力信號，最終導(dǎo)致胰腺疾病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［34-35］。

3.3 PSCs與炎性反應(yīng)

炎癥代表了一個基本的生物學(xué)自我修復(fù)過程，通過誘導(dǎo)各種修復(fù)機制恢復(fù)組織的穩(wěn)態(tài)。但是這種恢復(fù)可能不會充分發(fā)生，從而導(dǎo)致持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)，使炎性反應(yīng)持續(xù)存在并且被放大，該過程導(dǎo)致組織功能顯著改變，體內(nèi)平衡機制出現(xiàn)系統(tǒng)性和持續(xù)性紊亂，致使組織損傷［36］。在急性胰腺炎和2型糖尿病模型大鼠的血清中檢測到炎性標志物的水平明顯升高，且伴隨著胰腺組織水腫出血、纖維化加劇和胰島素分泌減少的現(xiàn)象，使胰腺處于長期炎癥狀態(tài)。在慢性炎癥和氧化應(yīng)激的作用下，靜息狀態(tài)下的PSCs被組織的炎癥微環(huán)境持續(xù)激活，活化的PSCs激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進入細胞核，誘導(dǎo)許多基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控不同的細胞，其中就包括巨噬細胞和中性粒細胞等炎性細胞的激活并迅速增殖。NF-κB 途徑還與氧化應(yīng)激有關(guān)，活化的NFκB可誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞代謝產(chǎn)物，刺激大量PSCs激活，進一步加劇炎癥和氧化應(yīng)激，并促進胰腺細胞凋亡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞功能障礙［20］。此外，活化的PSCs也會刺激巨噬細胞活化，巨噬細胞在組織炎癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用，巨噬細胞表現(xiàn)出介于兩個極端之間的表型：M1 型（促炎性）和M2 型（消炎性）?；罨腜SCs又會通過旁分泌方式，分泌一些炎性因子和趨化因子，例如白細胞介素IL-6、IL-8 和TNF-α等［14］，這些細胞因子促使機體炎性反應(yīng)往不可控的方向發(fā)展，使慢性炎癥持續(xù)存在并放大，加快了急性胰腺炎和2型糖尿病的進程，甚至最終轉(zhuǎn)變成胰腺癌。

4 通過靶向抑制PSCs 治療胰腺疾病的研究前景

動物模型和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，活化的PSCs在胰腺疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。不同胰腺疾病的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，PSCs 發(fā)揮作用主要是在纖維化、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等方面，提示通過抑制PSCs活化可能預(yù)防各類胰腺疾病的發(fā)生，并據(jù)此研發(fā)相關(guān)的治療藥物。未來的研究內(nèi)容可以包括：開展體內(nèi)和體外實驗，探究PSCs 對胰腺的損傷和致病機制；開展體內(nèi)實驗，通過藥物干預(yù)探究PSCs對纖維化、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的作用；探究PSCs的狀態(tài)，或者通過提取胰腺疾病模型動物體內(nèi)的原代PSCs，在體外實驗研究其與胰腺其他細胞的互作關(guān)系，進一步驗證PSCs對胰腺功能的影響，為研究和開發(fā)此類疾病的治療藥物提供基礎(chǔ)。

4.1 從纖維化的角度治療胰腺疾病

PSCs 的激活是胰腺纖維化發(fā)展的重要過程，可導(dǎo)致2型糖尿病和胰腺導(dǎo)管癌［37］。活化的PSCs已被認為是胰腺纖維化的關(guān)鍵起始分子，也是胰腺癌的重要標志［38］。一些特定的植物提取物可作為新的抗纖維化制劑，例如姜黃素（curcumin）可用于靶向治療胰腺纖維化以及抑制PSCs活化和腫瘤干細胞增殖，其治療原理是抑制血小板衍生生長因子的增殖誘導(dǎo)作用，使活化的PSCs 和腫瘤干細胞停滯在G0/G1期，最終使細胞凋亡，減少細胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生［39］。此外，鞣花酸（ellagic acid）能夠抑制c-Raf/MAPK/ERK 和PI3K/AKT下游信號通路的激活，這些信號通路對PSCs細胞增殖和遷移很重要；而且鞣花酸可以通過降低α-SMA蛋白和ECM 前膠原Ⅰ、Ⅲ型蛋白水平，使PSCs 失活［40］。因此，抗纖維化療法已被確定為是一種通過靶向抑制PSCs活化治療胰腺疾病的新策略。

4.2 從氧化應(yīng)激的角度治療胰腺疾病

從氧化應(yīng)激的角度調(diào)控PSCs達到治療胰腺疾病的目的，主要是通過抗氧化劑干預(yù)來實現(xiàn)。已知大量飲酒會造成急性胰腺炎，其原理是乙醇通過氧化應(yīng)激反應(yīng)來激活PSCs，促使PSCs的細胞膜脂質(zhì)過氧化，以及總超氧化物歧化酶過量表達。而綠茶中的綠茶多酚主要活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）具有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 預(yù)處理可以抑制乙醇誘導(dǎo)的體外PSCs 活化［41］。已知乙醇能夠顯著增加α-SMA 蛋白（Ⅰ型前膠原）表達，激活TGF-β1，并誘導(dǎo)p38 MAPK 磷酸化。而EGCG 治療能夠顯著降低所有這些因子的生成，并且徹底消除p38 MAPK 磷酸化［41］。此外有研究證實，EGCG 可以通過調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，下調(diào)HSCs 中促纖維化標志物（如Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白和α-SMA）的基因表達，減弱ROS 誘導(dǎo)的肝細胞死亡，從而減少肝纖維化［42］。而HSCs 和PSCs 的性質(zhì)類似，提示EGCG 也可能通過減少胰腺纖維化，預(yù)防胰腺疾病的發(fā)生。

另有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇（resveratrol）通過下調(diào)微RNA21（microRNA21，miR21）表達、增加張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）蛋白水平來阻止ROS誘導(dǎo)的PSCs活化、侵襲、遷移和糖酵解；進一步研究證明，白藜蘆醇可以通過抑制ROS/miR21 介導(dǎo)的PSCs活化和糖酵解來抑制胰腺癌細胞的侵襲和遷移，達到靶向治療胰腺癌的目的［43］。

4.3 從炎性反應(yīng)的角度治療胰腺疾病

靜息狀態(tài)的PSCs 因機體處于炎癥狀態(tài)而被激活，活化的PSCs通過NF-κB途徑分泌一些趨化因子和生長因子，從而介導(dǎo)和加劇炎癥。所以，通過誘導(dǎo)PSCs凋亡，可抑制NF-κB的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，加速組織從炎性反應(yīng)中恢復(fù)。例如常見的糖尿病治療藥物二甲雙胍，通過重編程PSCs和腫瘤相關(guān)巨噬細胞可減輕胰腺癌患者炎癥，對活化的PSCs具有抑制增殖和促凋亡的作用，可減弱NF-κB途徑造成的炎性反應(yīng)，一定程度上減緩了2型糖尿病的癥狀［44］。姜黃素類似物L(fēng)49H37通過降低ERK1/2 激酶的磷酸化水平，下調(diào)p21 水平，導(dǎo)致G0/G1期依賴性細胞周期停滯，抑制活化的PSCs增殖并誘導(dǎo)凋亡，減少了眾多炎性因子的旁分泌，降低組織炎癥損傷水平［45］。

綜上所述，在急性胰腺炎、2型糖尿病和胰腺導(dǎo)管癌動物模型中，活化的PSCs 能夠促進胰腺組織纖維化，在氧化應(yīng)激信號通路中發(fā)揮傳導(dǎo)功能，促使機體炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胰腺疾病的發(fā)生。因此，靶向抑制PSCs的活化能夠減輕胰腺細胞的損傷，減緩胰腺疾病的發(fā)生發(fā)展，這可能為治療胰腺疾病提供了一種新思路。