賀麗迎, 唐曉琴*, 趙 艦, 楊乾展, 李 莉

(1. 重慶市疾病預(yù)防控制中心, 重慶 400042; 2. 島津企業(yè)管理(中國)有限公司重慶分公司, 重慶 400010)

毒蘑菇亦稱毒蕈、毒菌等,人或畜禽食用后能產(chǎn)生中毒反應(yīng)[1]。我國已知的毒蘑菇有435種[2],每年因誤采食毒蘑菇而中毒的事件屢見不鮮,其導(dǎo)致死亡人數(shù)占整個食物中毒死亡人數(shù)的比例超過35%[3],高達(dá)70.49%的毒蘑菇中毒事件由誤食劇毒鵝膏菌引起[4]。毒蘑菇的毒素可分為環(huán)肽類、奧來毒素、毒蕈堿類等,引起中毒的主要是鵝膏肽類毒素,其屬于環(huán)肽類毒素,為最主要致死毒素,常存在于鵝膏屬、環(huán)柄菇屬的部分品種中[5]。鵝膏肽類毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,耐高溫,一般的烹調(diào)加工不會破壞其毒性,由該類毒素引起的中毒死亡病例占毒蘑菇中毒死亡病例的90%以上[6],且目前尚未發(fā)現(xiàn)特效解毒劑,因此掌握鵝膏肽類毒素的快速檢測技術(shù)和方法顯得尤為重要。根據(jù)鵝膏肽類毒素的氨基酸組成和結(jié)構(gòu),分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘素3類[7]。毒傘素致命性相對較弱,相關(guān)研究較少。鵝膏毒肽為雙環(huán)八肽,以α-鵝膏毒肽(α-AMA)、β-鵝膏毒肽(β-AMA)和γ-鵝膏毒肽(γ-AMA)3種毒素毒性最大,在毒蘑菇中含量也較高,為引起中毒的主要毒素,人的致死劑量約為0.1 mg/kg[8]。鬼筆毒肽為雙環(huán)七肽,主要有二羥鬼筆毒肽(POD)、羧基二羥鬼筆毒肽(PCD),鬼筆毒肽類毒素不能經(jīng)消化道吸收,但含有鬼筆毒肽類毒素的蘑菇多同時含有鵝膏毒肽,因此一般也同時作為監(jiān)測目標(biāo)[9-12]。

鵝膏毒肽早期的檢測方法主要有化學(xué)顯色法[13,14]、酶聯(lián)免疫吸附法[15,16]、毛細(xì)管電泳法[17,18]、高效液相色譜法[19,20]等。近年來液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]逐漸成為主流檢測方法,該法取樣量少,較前述其他方法靈敏度更高,定性定量能力更好,但該法的質(zhì)量分析器以低分辨率和整數(shù)質(zhì)量精度的四極桿為主,毒蘑菇樣品通常含有較多的多糖、氨基酸、多肽及有機(jī)酸等復(fù)雜基質(zhì),需要較為繁瑣的前處理操作以排除基質(zhì)的干擾。也有部分報道利用高分辨率的四極桿飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF)[25,26]檢測,但其分辨率不及四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q/Orbitrap HRMS)。Q-ExactiveTM組合型四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀將四極桿的母離子高性能選擇性與靜電場軌道阱高分辨的精確質(zhì)量數(shù)相結(jié)合,能在單次分析中定性、定量檢測復(fù)雜混合物中痕量水平的代謝物、污染物、肽類和蛋白質(zhì)。與三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式不同,Q-ExactiveTM質(zhì)譜儀在全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描(Full mass-ddMS2)模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描的同時,對一級質(zhì)譜中豐度高的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,可快速定性。在目標(biāo)離子選擇性掃描(Targeted-SIM)模式下,利用目標(biāo)物母離子的精確質(zhì)荷比直接定量,無需對目標(biāo)物逐個優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù),降低檢測時間的同時又能很好地避免受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。在二級質(zhì)譜模式下,可直接比對碎片離子精確質(zhì)荷比,在無標(biāo)準(zhǔn)品的情況下其定性結(jié)果也具有一定的可信度,在突發(fā)食物中毒事件時,更加有助于樣品的快速篩查和定量分析[27-29]。目前鮮有運(yùn)用四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)對鵝膏肽類毒素進(jìn)行鑒定檢測的研究,近兩年開始有文獻(xiàn)報道但所涉及的鵝膏肽類毒素種類較少[30,31]。本研究建立的毒蘑菇中5種鵝膏肽類毒素定性定量檢測的方法,前處理過程簡便,分析時間短,測定結(jié)果準(zhǔn)確,為毒蘑菇中毒的快速確證分析提供了參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司); Q-ExactiveTM四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Multifuge X1R離心機(jī)(美國Thermo公司); Milli-Q Integral 3超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

α-鵝膏毒肽(純度≥90%)、β-鵝膏毒肽(純度≥90%)、γ-鵝膏毒肽(純度≥90%)、二羥鬼筆毒肽(純度≥90%)、羧基二羥鬼筆毒肽(純度≥90%)均購自美國Enzo公司;乙腈和甲醇均為色譜級(純度≥99.9%),乙酸銨為質(zhì)譜級(純度≥99.9%),均購自美國Thermo公司;甲酸為色譜級(純度≥98%),購自上海安譜實驗科技股份有限公司;氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%),購自德國Merck公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取5種鵝膏肽類毒素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于-20 ℃避光保存。分析時以乙腈-水(50∶50, v/v)溶液逐級稀釋,配制1.0～20.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品制備

新鮮野生菌樣品經(jīng)組織勻漿機(jī)勻漿后,于-20 ℃保存,準(zhǔn)確稱取勻漿后的試樣1 g(精確至0.01 g)于15 mL聚丙烯刻度離心管中,加入20 mL超純水,渦旋混勻30 s,超聲提取10 min, 12 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm聚四氟乙烯(PTFE)濾膜后,上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.0 mm, 2.1 μm);流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;流動相:A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸), B為乙腈。梯度洗脫:0～1 min, 5%B; 1～9 min, 5%B～55%B。進(jìn)樣體積:5.0 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:可加熱電噴霧離子源(HESI);噴霧電壓:3.50 kV;毛細(xì)管溫度:350 ℃;加熱溫度:350 ℃;鞘氣:45 arb;輔助氣:11 arb;掃描模式1: Full mass-ddMS2,正離子采集模式,Full mass分辨率70 000 FWHM, ddMS2分辨率17 500 FWHM;掃描模式2: Targeted-SIM,正離子采集模式,分辨率70 000 FWHM。各個化合物的質(zhì)譜信息見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

鵝膏毒肽和鬼筆毒肽為多肽類環(huán)狀化合物,具有較強(qiáng)極性,本方法采用能夠增強(qiáng)對極性分子反相保留的HSS T3高強(qiáng)度硅膠基質(zhì)色譜柱分離,考察了甲醇-水體系和乙腈-水體系在梯度洗脫條件下對5種鵝膏肽類毒素峰形、分離度和靈敏度的影響。水體系分別采用0.05%氨水水溶液、0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)。結(jié)果表明,甲醇-水體系中部分化合物的色譜峰存在不同程度的拖尾、展寬現(xiàn)象,乙腈-水體系可顯著改善化合物的峰形,不同化合物的靈敏度均優(yōu)于甲醇-水體系。在乙腈-水體系中,當(dāng)水體系為0.05%氨水水溶液時,α-鵝膏毒肽m/z919.360 96的分子離子峰的響應(yīng)大幅降低,同一保留時間出現(xiàn)豐度較高的m/z917.347 68離子峰,根據(jù)精確質(zhì)荷比計算得到其為[C39H53N10O14S]+[32],推測為α-鵝膏毒肽脫去2個氫的產(chǎn)物,由于其豐度較高,[M+H]+分子離子峰的形成受到抑制,與之結(jié)構(gòu)相似的γ-鵝膏毒肽也有類似現(xiàn)象。對于二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽,氨水體系中除m/z789.323 94和m/z847.328 63的峰外,還出現(xiàn)了與[M+H]+分子離子峰豐度相當(dāng)?shù)腫M+Na]+峰(m/z811.308 37和m/z869.315 04),推測堿性條件下,化合物中的O、S原子容易捕獲Na+而形成帶電粒子,形成[M+Na]+的概率增加,使[M+H]+分子離子峰的形成受到抑制,一定程度下影響了檢測的靈敏度。當(dāng)水體系為0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)時,由于H+濃度更高,二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的[M+Na]+峰受到極大抑制,豐度降至[M+H]+峰的10%以下。但乙酸銨-甲酸體系的分離度略優(yōu)于甲酸體系,故選用乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)進(jìn)行分離,圖1為5種鵝膏肽類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖。

圖 1 5種鵝膏肽類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the five amanita peptide toxins (100 μg/L) in the mixed standard solution

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的分子質(zhì)量相差1 Da,且具有相同的子離子,根據(jù)13C在自然界中的天然豐度計算,含有13C的α-鵝膏毒肽同位素峰的豐度約為不含13C的43%,當(dāng)α-鵝膏毒肽分子含有一個13C時(分子式為13C1C38H54N10O14S),其[M+H]+峰m/z為920.359 36,而β-鵝膏毒肽的[M+H]+峰m/z也為920.345 65,因此α-鵝膏毒肽的同位素峰會對β-鵝膏毒肽的檢測造成干擾,在低分辨質(zhì)譜上無法區(qū)分,必須盡量通過液相色譜實現(xiàn)基線分離。在使用高分辨質(zhì)譜時,α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽精確質(zhì)荷比的差異使得兩者在提取離子色譜圖和一級質(zhì)譜圖中出峰互不干擾,故對色譜分離條件更為寬容。

為使各化合物更好地離子化,采用流動注射進(jìn)樣方式,將500 μg/L的各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜儀。在Full mass模式下,根據(jù)目標(biāo)化合物分子式組成,推算其分子離子峰的理論質(zhì)荷比,與實測值比較,一般兩者的質(zhì)量誤差應(yīng)小于5×10-6。同時在Full mass-ddMS2模式下,通過色譜分離,優(yōu)化各化合物的歸一化碰撞能(NCE),得到化合物的二級質(zhì)譜碎片,選擇豐度較高的2個碎片離子作為定性特征離子。

5種鵝膏肽類毒素的分子式、保留時間、理論和實測精確質(zhì)量數(shù)、主要碎片離子及質(zhì)量誤差等質(zhì)譜信息見表1,其一級質(zhì)譜及二級碎片離子質(zhì)譜圖見圖2。

表 1 5種鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜信息Table 1 MS information of the five amanita peptide toxins

圖 2 5種鵝膏肽類毒素的一級質(zhì)譜及二級碎片離子質(zhì)譜圖Fig. 2 MS1 and MS2 spectra of the five amanita peptide toxins

2.3 質(zhì)譜碎裂途徑

鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的分子結(jié)構(gòu)是由氨基酸通過酰胺鍵首尾連接形成的環(huán)肽毒素,相對S-C鍵,氨基酸之間的肽鍵更不穩(wěn)定,因此,高碰撞能量下的裂解一般發(fā)生在氨基酸之間的酰胺鍵上[32]。根據(jù)Mass Frontier 7.0結(jié)構(gòu)鑒定軟件解析5種鵝膏肽類毒素的二級質(zhì)譜,結(jié)合碎片離子精確質(zhì)荷比,推測其碎裂途徑見圖3,結(jié)構(gòu)式淺色部分為可能丟失的斷裂結(jié)構(gòu),下方為該化合物二級碎片離子的質(zhì)量數(shù)。α-鵝膏毒肽與β-鵝膏毒肽具有相同的骨架結(jié)構(gòu),僅在R2取代基上有氨基與羥基的不同,α-鵝膏毒肽得到相對豐度較強(qiáng)的m/z259.122 84、m/z86.060 51質(zhì)譜峰,β-鵝膏毒肽得到相對豐度較強(qiáng)的m/z259.128 56、m/z86.060 47質(zhì)譜峰。γ-鵝膏毒肽除m/z86.060 46質(zhì)譜峰外,有相對豐度較強(qiáng)的m/z243.133 86質(zhì)譜峰,其與α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽的m/z259.122 84、m/z259.128 56質(zhì)譜峰相差16 Da,γ-鵝膏毒肽R1為一個氫,與α-鵝膏毒肽分子式相差一個氧原子,這也佐證了碎裂途徑2。二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽均可得到相對豐度較強(qiáng)的m/z185.093 18、m/z330.144 51質(zhì)譜峰,羧基二羥鬼筆毒肽可得到相對豐度較強(qiáng)的m/z185.092 37、m/z330.144 38質(zhì)譜峰。

圖 3 5種鵝膏肽類毒素的結(jié)構(gòu)式及其二級質(zhì)譜碎裂途徑Fig. 3 Structural formulas and MS2 collision ways of the five amanita peptide toxins

2.4 前處理條件的選擇

鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的分子結(jié)構(gòu)中含有較多羥基、氨基等,極性較強(qiáng),易溶于水、甲醇、乙腈等溶劑,發(fā)生急性中毒時需要以最快的速度進(jìn)行定性和定量檢測,所以不宜采用固相萃取等前處理時間較長的凈化方法。故嘗試以純水、甲醇、甲醇-水(50∶50, v/v)、乙腈、乙腈-水(50∶50, v/v)作為提取溶劑,在預(yù)先加標(biāo)的空白樣品中對目標(biāo)物進(jìn)行提取,分析不同提取條件下5種鵝膏肽類毒素的響應(yīng)值和回收率。結(jié)果顯示,純乙腈提取進(jìn)樣時,樣品提取溶劑與流動相不一致而產(chǎn)生了溶劑效應(yīng),導(dǎo)致α-鵝膏毒肽與β-鵝膏毒肽色譜峰有前伸現(xiàn)象。其余提取試劑的響應(yīng)較好,回收率均大于80%,且未有明顯的基質(zhì)效應(yīng),符合中毒事件快速定性要求?？紤]到對環(huán)境影響較小,故選擇純水作為提取試劑。當(dāng)離心速度為5 000 r/min時,水提取液有混濁現(xiàn)象,提高到12 000 r/min后可得到澄清溶液,故將離心速度設(shè)定為12 000 r/min。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的研究

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)是指從樣品中與目標(biāo)物同時提取出來的物質(zhì)引起的目標(biāo)物分析信號抑制或增強(qiáng)的現(xiàn)象,ME值可按下式進(jìn)行量化評估[33]。

ME為正值時,基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為增強(qiáng)效應(yīng),反之減弱。當(dāng)ME值小于20%時,則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對定量分析沒有顯著影響,可以忽略。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的ME分別為-10.8%、-11.9%、-11.3%、-9.5%、-10.6%,可見5種鵝膏肽類毒素的基質(zhì)抑制效應(yīng)可以忽略。

2.6 方法的線性關(guān)系、檢出限與定量限

精確配制1、2、5、10、15、20 μg/L的5種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,Targeted-SIM模式下測定。以化合物的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),化合物準(zhǔn)分子離子色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r),結(jié)果見表2。5種鵝膏肽類毒素在1.0 ～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.997 4～0.998 9。以化合物準(zhǔn)分子離子色譜峰的3倍和10倍信噪比(S/N)對應(yīng)樣品中目標(biāo)物的濃度,作為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果表明,5種鵝膏肽類毒素的檢出限為0.006 mg/kg,定量限為0.02 mg/kg。

表 2 5種鵝膏肽類毒素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of the five amanita peptide toxins

2.7 回收率與精密度

取空白蘑菇樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,分別添加低、中、高3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),每個水平重復(fù)測定6次,考察方法的準(zhǔn)確度(回收率)和精密度,結(jié)果如表3所示。5種鵝膏肽類毒素的回收率為81.8%～102.4%,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%～8.3%。

表 3 5種鵝膏肽類毒素的平均加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the five amanita peptide toxins (n=6)

2.8 樣品檢測

2.8.1樣品的定性定量分析

應(yīng)用本方法對采集的肉褐鱗環(huán)柄菇進(jìn)行檢測,樣品按1.3節(jié)制備后進(jìn)樣分析。5種鵝膏肽類毒素的提取離子色譜圖見圖4,該樣品有與α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽保留時間一致的色譜峰,γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的提取離子未見相應(yīng)的色譜峰。圖4也提供了樣品中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽的一級質(zhì)譜和二級碎片離子質(zhì)譜圖,樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液相比,α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽一級質(zhì)譜和二級碎片離子的質(zhì)量誤差均小于5×10-6。樣品中檢出的α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽含量分別為347.1 mg/kg和92.7 mg/kg。

圖 4 樣品中鵝膏肽類毒素的提取離子色譜圖及α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽的一級質(zhì)譜和二級碎片離子質(zhì)譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of the amanita peptide toxins and MS1 and MS2 spectra of α-amanita and β-amanita in sample

2.8.2樣品中未知物的結(jié)構(gòu)分析

圖4中有一化合物保留時間為6.13 min,該化合物一級質(zhì)譜及二級碎片離子質(zhì)譜圖見圖5。由于無標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對,根據(jù)其[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰(m/z903.366 48)推測其為γ-鵝膏毒肽的同分異構(gòu)體。該化合物的分子質(zhì)量為902.3 Da,分子結(jié)構(gòu)上比α-鵝膏毒肽少一個羥基。該化合物含有m/z259.128 88和m/z86.060 78碎片離子質(zhì)譜峰,與α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽碎片離子一致,推測其結(jié)構(gòu)與碎裂規(guī)律兩者類似。結(jié)合文獻(xiàn)[34]報道的三羥基鵝膏毒肽酰胺(amaninamide)結(jié)構(gòu)及碎裂規(guī)律推斷,該未知化合物可能的結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂途徑見圖6。由此可見,利用高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)荷比以及二級質(zhì)譜碎片信息,在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,可進(jìn)行未知化合物的結(jié)構(gòu)推斷,為快速鎖定化合物提供依據(jù)。

圖 5 未知化合物的一級質(zhì)譜和二級碎片離子質(zhì)譜圖Fig. 5 MS1 and MS2 spectra of unknown compound

圖 6 樣品中未知化合物推測的結(jié)構(gòu)式及碎裂途徑Fig. 6 Conjectured structural formula and collision ways of the unknown compound in sample

3 結(jié)論

本研究利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜建立了毒蘑菇中5種鵝膏肽類毒素的檢測方法。方法準(zhǔn)確、快速,靈敏度高,可同時進(jìn)行定性定量測定,并可延伸至未知化合物的結(jié)構(gòu)推斷。在此基礎(chǔ)上,可進(jìn)一步建立鵝膏肽類毒素非靶向篩查方法和篩查數(shù)據(jù)庫,為突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測提供可靠的技術(shù)支持。