門 雪, 吳成新, 陳明麗, 王建華

(東北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系分析科學(xué)研究中心, 遼寧 沈陽 110819)

谷胱甘肽(GSH)是一種人體內(nèi)較豐富的含巰基的三肽化合物,在人體代謝中發(fā)揮重要的作用,如解毒作用和抗氧化作用等[1-5]。砷(As)和鉻(Cr)是工業(yè)上常用的兩種重金屬[6,7],其中As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)毒性較強(qiáng)且會(huì)通過呼吸道、消化道等方式進(jìn)入人體而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),從而引起人體內(nèi)GSH的變化[8,9]。人體內(nèi)GSH的水平變化與多種疾病密切相關(guān)[10],如糖尿病、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏癥等,研究發(fā)現(xiàn),腦谷胱甘肽是輕度認(rèn)知障礙和阿爾茨海默氏癥的一種新的生物標(biāo)志物[11]?，F(xiàn)在臨床上常用的GSH分析檢測方法包括電化學(xué)法[12]、熒光法[13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[14,15]、酶分析法[16,17]等。

毛細(xì)管電泳(CE)是一種具有納升級(jí)樣品量和較高分辨率等優(yōu)點(diǎn)的現(xiàn)代分離分析技術(shù),在生物樣品尤其是細(xì)胞檢測中具有極大的優(yōu)勢。激光誘導(dǎo)熒光法(LIF)是一種靈敏度極高的檢測器,因激光易于聚焦,具有高強(qiáng)度和單色性等特點(diǎn),尤其適合與樣品量極少的毛細(xì)管電泳聯(lián)用。CE-LIF聯(lián)用法具有靈敏度高、樣品量小和設(shè)備簡單易造等特點(diǎn),尤其適合細(xì)胞內(nèi)GSH的定量分析[18]。然而,上述方法中使用了乙腈等有機(jī)溶劑,有機(jī)溶劑的揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致方法的穩(wěn)定性較差。

本文構(gòu)建了毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng),優(yōu)化了緩沖溶液的成分和其他實(shí)驗(yàn)條件,建立了一種穩(wěn)定且靈敏的GSH檢測方法。研究了肝癌細(xì)胞(HepG2)內(nèi)GSH含量與金屬形態(tài)和濃度之間的關(guān)系,從結(jié)果可以看出,細(xì)胞內(nèi)GSH水平的變化,在一定程度上可以用來評(píng)估細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

構(gòu)建毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng),如圖1所示,其中,未修飾的熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μm,外徑360 μm,總長度29.5 cm,有效長度25.5 cm,河北永年銳灃色譜器件有限公司)作為分離毛細(xì)管。激光誘導(dǎo)熒光檢測器為實(shí)驗(yàn)室基于共聚焦模式自主搭建[19],其主要參數(shù)如下:473 nm激光(20 mW,遠(yuǎn)明激光,寧波)作為光源,激發(fā)光濾光片為470 nm的帶通濾光片(匯博光學(xué),沈陽),二向色鏡截止波長為500 nm(匯博光學(xué)),聚焦物鏡為40 X平場物鏡(型號(hào)NA. 0.6,工作距離3.98 mm,大悅維佳,北京),發(fā)射光濾光片為535 nm的帶通濾光片(匯博光學(xué)),采光針孔孔徑為0.4 mm,以光電倍增管(H10722-20,濱松,日本)作為光電探測器進(jìn)行光信號(hào)采集和轉(zhuǎn)換,以數(shù)據(jù)采集卡(USB-6009, National Instruments,美國)及實(shí)驗(yàn)室在LabVIEW平臺(tái)編寫的相關(guān)軟件進(jìn)行儀器控制及數(shù)據(jù)采集。Allegra高速冷凍離心機(jī)和HERA Cell 150細(xì)胞培養(yǎng)箱分別購自美國Beckman Coulter公司和美國Thermo Scientific公司。SynergyH1酶標(biāo)儀和BX53M正置顯微鏡購自美國BioTek公司和日本Olympus公司。KQ-100DB超聲波清洗器和08-Ⅲ非接觸式超聲波細(xì)胞破碎儀分別購自江蘇昆山市超聲儀器有限公司和寧波新芝生物科技股份有限公司。XPE105DR分析天平購自上海梅特勒-托利多國際有限公司。

圖 1 毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detection device

硼砂(borate)、氫氧化鈉(NaOH)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、β-環(huán)糊精(β-CD)、亞砷酸鈉、砷酸氫二鈉、氯化鉻和重鉻酸鉀均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,2,3-萘二甲醛(NDA)、谷胱甘肽、十二烷基硫酸鈉(SDS)、曲拉通X100(Triton X100)、二甲基亞砜(DMSO)、鹽酸(HCl)、乙腈(色譜級(jí))和甲醇(色譜級(jí))購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自美侖生物技術(shù)有限公司,胎牛血清、抗生素(鏈霉素和青霉素)分別購自美國Clark和HyClone公司。HepG2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。實(shí)驗(yàn)室用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。除標(biāo)有純度的試劑外,以上試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量GSH固體,溶于超純水中,配制成10.00 mmol/L的GSH溶液備用,4 ℃避光保存。取適量GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用超純水稀釋成濃度分別為0.01、0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、20.00 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2培養(yǎng)基由50 mL胎牛血清(10%, v/v)、5 mL抗生素(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL)加入到450 mL DMEM高糖培養(yǎng)基中混合而成。HepG2細(xì)胞于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2細(xì)胞活力的測定

將HepG2細(xì)胞接種在96孔板中貼壁生長,然后加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液(0、2、5、10、20、50和100 mg/L)孵育6 h。用PBS清洗兩次,加入100 μL含有0.05 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育4 h。隨后,除去培養(yǎng)基,并在每個(gè)孔里加入150 μL DMSO(溶解甲瓚晶體),使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量每孔的吸光度。

1.3.3砷和鉻孵育的細(xì)胞樣品制備

將HepG2細(xì)胞分別接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中以貼壁生長,再加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液(2和5 mg/L)孵育6 h,同時(shí)設(shè)置空白對照組。用PBS清洗3次后,收集細(xì)胞,凍干后,加入100 μL背景緩沖溶液,超聲裂解后進(jìn)行超速離心(12 000 r/min, 15 min),收集細(xì)胞裂解液并存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4GSH的標(biāo)記和胞內(nèi)成像

標(biāo)記GSH:采用文獻(xiàn)報(bào)道的GSH標(biāo)記方法[20],并對該方法進(jìn)行了優(yōu)化。在背景緩沖溶液(20 mmol/L硼砂和2 mmol/Lβ-CD, pH 9.2)中加入1 μL GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μmol/L)和細(xì)胞裂解液,然后加入100 μmol/L的NDA溶液,反應(yīng)5 min后,樣品注入分離毛細(xì)管。

胞內(nèi)GSH成像:將HepG2細(xì)胞分別接種在96孔板中貼壁生長,再加入5 mg/L As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液孵育6 h。經(jīng)PBS清洗2次后,每個(gè)孔里加入200 μL 1 mmol/L的NDA溶液,室溫下避光孵育10 min。經(jīng)PBS清洗3次以終止染色。最后,在每個(gè)孔里加入500 μL PBS,在正置顯微鏡下觀察和記錄,放大倍數(shù)為10倍。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件與數(shù)據(jù)處理

1.4.1CE-LIF條件

毛細(xì)管在使用前依次用甲醇、超純水、0.1 mol/L NaOH、超純水、0.1 mol/L HCl、超純水各沖洗10 min。每次進(jìn)樣前,用0.1 mol/L NaOH、超純水和背景緩沖溶液沖洗1 min。重力進(jìn)樣,抬高10 cm,進(jìn)樣10 s,室溫20 ℃下,陽極進(jìn)樣,陰極檢測,電壓為14 kV,激發(fā)波長為473 nm,發(fā)射波長為528 nm。背景緩沖溶液、GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液和細(xì)胞裂解液在電泳之前需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜(水系)過濾,并超聲脫氣5 min。

1.4.2數(shù)據(jù)處理

GSH的定量數(shù)據(jù)通過實(shí)驗(yàn)室的電泳分析軟件計(jì)算峰面積后,再用Excel和GraphPad Prism進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。電泳圖直接由Origin Pro2016繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液種類和pH值的影響

電泳緩沖溶液對標(biāo)記反應(yīng)和電泳性能起著至關(guān)重要的作用。為了選擇合適的緩沖溶液,使用酶標(biāo)儀考察了在20 mmol/L的硼砂和Tris兩種緩沖溶液(Tris pH 7.4和pH 9.2,硼砂pH 9.2)下GSH(10.00 μmol/L)與NDA(100 μmol/L)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。每個(gè)條件運(yùn)行時(shí)間30 min,時(shí)間間隔1 min,激發(fā)波長設(shè)為473 nm,發(fā)射波長設(shè)為528 nm,檢測高度為4.4 mm。結(jié)果如圖2所示,在硼砂緩沖液中(pH 9.2), NDA自身不發(fā)熒光,當(dāng)加入GSH后,NDA衍生GSH產(chǎn)生熒光產(chǎn)物[20],在5 min內(nèi)達(dá)到反應(yīng)平衡且在30 min內(nèi)保持穩(wěn)定,而在Tris緩沖液中(pH 9.2), GSH與NDA反應(yīng)在25 min達(dá)到平衡,平衡時(shí)NDA-GSH的熒光強(qiáng)度也弱于在硼砂緩沖液(pH 9.2)中的熒光強(qiáng)度。在pH為7.4的Tris緩沖液中,反應(yīng)平衡時(shí)間相較于在pH為9.2的Tris緩沖液中縮短10 min,但熒光強(qiáng)度較弱?？紤]到反應(yīng)時(shí)間和熒光強(qiáng)度,選擇pH為9.2的硼砂緩沖液作為GSH電泳分析的緩沖液。

圖 2 背景緩沖液對GSH與NDA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響(n=3)Fig. 2 Effect of background buffers on reaction kinetics of NDA-GSH (n=3) NDA: 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde; GSH: glutathione; Tris: tris(hydroxymethyl)aminomethane.

2.1.2添加劑的選擇和條件優(yōu)化

為了在保證電泳穩(wěn)定性的同時(shí)提高NDA-GSH的靈敏度,使用酶標(biāo)儀考察了在20 mmol/L硼砂緩沖液中加入10 mmol/L SDS、5 mmol/L CTAB、5 mmol/L Triton X100和10 mmol/Lβ-CD時(shí)NDA-GSH的靈敏度。圖3a和3b中,反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的參數(shù)設(shè)置與2.1.1節(jié)相同，NDA-GSH的發(fā)射光譜是NDA與GSH衍生5 min后,在激發(fā)波長為473 nm下獲得的。結(jié)果表明,在硼砂緩沖液中加入以上4種添加劑后,NDA-GSH的靈敏度都有所提高,NDA-GSH的發(fā)光特性沒有明顯改變,發(fā)射波長保持在528 nm左右。當(dāng)CTAB和β-CD加入后,NDA-GSH的靈敏度明顯提高。SDS和Triton X100的加入也對提高NDA-GSH的靈敏度有所幫助,但是平衡時(shí)間在10 min內(nèi)。綜合考慮反應(yīng)時(shí)間和靈敏度,進(jìn)一步在緩沖液中加入CTAB和β-CD進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。如圖3c所示,當(dāng)加入CTAB后,沒有樣品峰出現(xiàn),可能是CTAB作為一種陽離子型表面活性劑,改變了電滲流的方向。當(dāng)加入β-CD后,NDA-GSH的信號(hào)明顯增強(qiáng),遷移時(shí)間也縮短至3 min內(nèi)。于是,進(jìn)一步考察了β-CD的濃度對NDA-GSH靈敏度的影響。隨著β-CD濃度的增加,NDA-GSH的遷移時(shí)間縮短,其信號(hào)強(qiáng)度先增大后減小,在β-CD濃度為2 mmol/L時(shí),NDA-GSH的信號(hào)最強(qiáng)(見圖3c)。因此,最終使用的背景緩沖溶液組成為20 mmol/L硼砂和2 mmol/Lβ-CD的混合溶液。

圖 3 硼砂緩沖液中的添加劑對NDA-GSH靈敏度的影響Fig. 3 Influence of additives in borate buffer on the sensitivity of NDA-GSH a. reaction kinetics of GSH with NDA (n=3); b. emission spectra of NDA-GSH; c. electrophoretograms of NDA-GSH. SDS: sodium dodecyl sulfate; CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide; β-CD: β-cyclodextrin. Peak identification: ※ NDA-GSH.

2.2 方法性能

2.2.1分析性能

采用1.2節(jié)的方法,制備0.01、0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、20.00 μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的條件下,每份溶液平行3次,用實(shí)驗(yàn)室的電泳分析軟件對峰面積積分,以峰面積為縱坐標(biāo)(y), GSH的濃度為橫坐標(biāo)(x, μmol/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,GSH在0.01～20.00 μmol/L范圍內(nèi),與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.21x+0.000 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 3。以信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)確定GSH的檢出限和定量限,分別為0.006 μmol/L和0.020 μmol/L。與現(xiàn)有的文獻(xiàn)[20]相比,該方法GSH的檢測靈敏度提高了約40倍。

2.2.2準(zhǔn)確度和精密度

以稀釋200倍的空白細(xì)胞裂解液為基質(zhì)進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)濃度分別為0.10、1.00、10.00 μmol/L,在優(yōu)化的條件下,每個(gè)水平平行測定3次。結(jié)果如表1所示,GSH的回收率為95.7%～112.6%,精密度為3.8%～5.0%,表明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好,證明了其在細(xì)胞內(nèi)GSH分析中的可靠性。

表 1 GSH在細(xì)胞裂解液中的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of GSH in cell lysate (n=3)

2.3 砷和鉻對HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響

2.3.1細(xì)胞活性和形態(tài)

為了研究砷和鉻對HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的毒性大小與細(xì)胞內(nèi)GSH含量的關(guān)系,首先考察了不同價(jià)態(tài)的砷和鉻對細(xì)胞的活性影響(見圖4)。從圖4可知,在研究的濃度范圍內(nèi),As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對細(xì)胞的毒性隨濃度的增加逐漸增大,而As(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)沒有表現(xiàn)出對細(xì)胞有明顯的毒性。質(zhì)量濃度為5 mg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對細(xì)胞刺激后的細(xì)胞活性分別為96%、98%、96%和89%。4種元素形態(tài)對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性大小順序?yàn)?Cr(Ⅵ)>As(Ⅲ)≈Cr(Ⅲ)>As(Ⅴ)。考察了2 mg/L(低劑量)和5 mg/L(高劑量)的4種元素形態(tài)對細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響。根據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道,細(xì)胞內(nèi)GSH的含量隨著暴露金屬濃度的增加而減少。因此,考察了高劑量的4種元素刺激細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞成像效果。如圖4所示,以高劑量刺激細(xì)胞仍然可以檢測到NDA-GSH的熒光信號(hào),表明以高劑量刺激細(xì)胞確保了細(xì)胞內(nèi)可檢測的GSH,并且不會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)。另外,通過Image J軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析,5 mg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對細(xì)胞刺激后的胞內(nèi)NDA-GSH的平均熒光強(qiáng)度值依次為69.9、54.1、62.6、54.7和48.5。平均熒光強(qiáng)度值越大,說明GSH含量越高。Cr(Ⅵ)刺激后胞內(nèi)的NDA-GSH熒光強(qiáng)度最低,說明胞內(nèi)GSH含量最低,并且Cr(Ⅵ)的細(xì)胞毒性最強(qiáng)。初步表明細(xì)胞毒性越強(qiáng),其胞內(nèi)GSH含量越低。

圖 4 (a)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性(n=4)和(b)胞內(nèi)GSH成像Fig. 4 (a) Cell viability (n=4) and (b) intracellular GSH imaging of HepG2 cells HepG2 cells were stimulated with As(Ⅲ), As(Ⅴ), Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) for 6 h.

2.3.2砷和鉻的形態(tài)和濃度對HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響

用構(gòu)建的毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)研究了砷和鉻的形態(tài)和濃度對HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響。以低劑量和高劑量As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)刺激HepG2細(xì)胞6 h后,在優(yōu)化的電泳條件下,胞內(nèi)的GSH含量和細(xì)胞裂解液電泳結(jié)果如圖5所示,通過與標(biāo)準(zhǔn)品電泳譜圖的遷移時(shí)間比對和標(biāo)準(zhǔn)加入法來鑒別細(xì)胞裂解液中的GSH。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相比對照組,以低劑量和高劑量的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)刺激細(xì)胞,胞內(nèi)GSH的含量變化沒有顯著差異。然而,相比對照組,以高劑量Cr(Ⅵ)刺激細(xì)胞,胞內(nèi)GSH的含量顯著降低(P<0.01),并且胞內(nèi)GSH的含量與以高劑量Cr(Ⅲ)刺激細(xì)胞時(shí)具有明顯差異(P<0.05)。這進(jìn)一步表明了細(xì)胞毒性越大,胞內(nèi)GSH的含量越低。

圖 5 (a)HepG2細(xì)胞內(nèi)的GSH含量的統(tǒng)計(jì)分析(n=3)和(b)細(xì)胞裂解液的電泳圖Fig. 5 (a) Statistical analysis of GSH content in HepG2 cells (n=3) and (b) electrophoretograms of the cell lysate a. HepG2 cells were stimulated by As(Ⅲ), As(Ⅴ), Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) for 6 h (n=3, t-test, **P<0.01, * P<0.05, comparison of differences between the two groups).

3 結(jié)論

本研究建立了一種毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測HepG2細(xì)胞中GSH含量的方法。通過該方法研究了砷和鉻的形態(tài)和濃度對HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響,以毒性較強(qiáng)的高劑量Cr(Ⅵ)刺激細(xì)胞導(dǎo)致胞內(nèi)GSH含量顯著降低,表明胞內(nèi)GSH含量與細(xì)胞毒性相關(guān),即細(xì)胞毒性越大,胞內(nèi)GSH的含量越低。該方法靈敏度高,穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高,為重金屬的濃度監(jiān)測和評(píng)估重金屬對細(xì)胞的毒性影響提供了新的手段。