迪麗娜爾·牙生，符雪月，曾曉鈴，郭春榮，王慧雯，董 璐，鄭小宇，陳 丹，孫勇新，孫祝美

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)·上海 201203；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院·上海 200032)

慢性胃炎是發(fā)病率較高的慢性病,且伴隨著萎縮與腸化生的出現(xiàn)，檢出率與胃癌的發(fā)生呈正相關(guān)[1]。中國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，慢性胃炎作為胃癌最常見的癌前疾病，其患病率一直處于較高水平[2]。慢性胃炎是一種多步驟、進(jìn)行性和終身的炎癥，目前已被學(xué)界廣泛接受的慢性胃炎演變模型為：正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→腸型胃癌[3-4]。因此，慢性胃炎的預(yù)防和診治越來(lái)越受到人們的關(guān)注。Wnt信號(hào)通路與“炎癌轉(zhuǎn)化”密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路最常見功能主要是胚胎發(fā)育和癌癥，但也參與成年動(dòng)物的正常生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中存在多個(gè)與胃癌及癌前病變發(fā)生、發(fā)展機(jī)制相關(guān)的作用靶點(diǎn)[5]。

升陽(yáng)益胃湯來(lái)源于李東垣《脾胃論》的《內(nèi)外傷辨惑論》，為“肺之脾胃虛”代表方[6]。據(jù)相關(guān)研究顯示，升陽(yáng)益胃湯治療慢性胃炎臨床療效理想，能保護(hù)慢性胃炎大鼠胃黏膜，提高機(jī)體免疫力，使黏膜得以修復(fù)，還可以調(diào)控信號(hào)通路改善胃黏膜萎縮狀態(tài)[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，觀察升陽(yáng)益胃湯對(duì)慢性胃炎小鼠胃組織Wnt信號(hào)通路中的β-catenin和Wnt2蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究提供前期實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性昆明種小鼠40只，9周齡，體質(zhì)量(25±0.9)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：PZSHUTCM201030015,飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，溫度控制在20 ℃～26 ℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%。

1.2 藥物與試劑 升陽(yáng)益胃湯方的組成：黃芪30 g，半夏9 g，黨參10g，炙甘草10 g，獨(dú)活10 g，防風(fēng)10 g，白芍30 g，羌活10 g，橘皮12 g，茯苓30 g，柴胡10 g，澤瀉10 g，炒白術(shù)1 0g，黃連6 g，加水浸泡1 h，頭煎加水為總藥量的10倍，二煎加水為總藥量的4倍，取汁去渣，合并兩次藥汁，蒸發(fā)濃縮至含生藥1 g/mL，密封在無(wú)菌量瓶中備用。氫氧化鋁：拜耳醫(yī)藥保健有限公司。2%水楊酸鈉溶液：國(guó)藥集團(tuán)有限公司，貨號(hào)20200429；WNT2 抗體：Proteintech公司，貨號(hào)66656-1-lg；β-Catenin抗體：Proteintech公司，貨號(hào)17565-1-AP。

1.3 主要儀器 生物顯微鏡：萊卡儀器有限公司；RM2135 石蠟切片機(jī)：萊卡儀器有限公司；IX71熒光顯微鏡：Olympus。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為正常組、模型組、升陽(yáng)益胃湯組、西藥組，每組各10只。 以2%水楊酸鈉2 mL每天灌胃，前3 周正常飲食，后3 周單日禁食，雙日足量進(jìn)食，結(jié)合饑餓飽餐因素，共6 周成模[9]。中藥組灌胃給予升陽(yáng)益胃湯劑(10 g/kg)；正常組、模型組分別灌胃等量的生理鹽水，西藥組灌胃氫氧化鋁混懸液(0.33 mg/kg)[10]，每天1 次。連續(xù)給藥30 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 胃組織病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥后，禁食24 h，打開腹腔，取出全胃，沿胃大彎剪開，取胃組織，放入4%多聚甲醛，脫水、透明石蠟包埋，切片(5 μm)，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察胃組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.2.2 免疫熒光法檢測(cè)胃組織Wnt2、β-catenin表達(dá) 處死小鼠后快速取胃組織，投入液氮快速冷凍，冰凍切片，片厚15 μm，Wnt2一抗：1∶200(兔抗大鼠)4 ℃冰箱過(guò)夜，二抗，1∶400，熒光標(biāo)記的抗兔的抗體，室溫，孵育1 h；β-catenin一抗：1∶1 000(兔抗大鼠)，37 ℃，孵育2 h，二抗，1∶500，熒光標(biāo)記的抗兔的抗體，37 ℃，孵育1 h。貼片封片，熒光顯微鏡觀察并進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠胃組織病理學(xué)變化 胃組織HE染色結(jié)果顯示：正常組胃黏膜完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組胃黏膜變薄，腺體萎縮、減少，排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；升陽(yáng)益胃湯組胃黏膜腺體病變減輕，排列較整齊，腺體數(shù)目增多；西藥組胃黏膜腺體萎縮較明顯，排列較為松散，腺體數(shù)目較少，有少量炎性細(xì)胞，與正常組胃黏膜差別明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠胃組織病理變化(HE，×100)

3.2 各組小鼠胃組織Wnt2和β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 模型組小鼠胃組織Wnt2、β-catenin熒光強(qiáng)度較正常組顯著增強(qiáng)；升陽(yáng)益胃湯組小鼠胃組織Wnt2、β-catenin熒光表達(dá)強(qiáng)度低于模型組但高于正常組；西藥組小鼠胃組織Wnt2、β-catenin熒光表達(dá)強(qiáng)度接近于模型組。見圖2～圖3，表1。

圖2 各組小鼠胃組織Wnt2蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果(免疫熒光，×200)

圖3 各組小鼠胃組織β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果(免疫熒光，×200)

表1 各組小鼠胃組織Wnt2和β-catenin蛋白表達(dá)的平均光密度比較

4 討論

中醫(yī)學(xué)中將慢性胃炎的病機(jī)分為肝胃氣滯證、肝胃郁熱證、脾胃虛弱證、脾胃濕熱證、胃陰不足證、胃絡(luò)瘀血證六型[11]；但均以脾胃虛弱為慢性胃炎的病理基礎(chǔ)，貫穿整個(gè)疾病的始終[12]。升陽(yáng)益胃湯有升清降濁之效，補(bǔ)中有散，發(fā)中有收，對(duì)慢性胃炎證屬脾胃虛弱患者療效顯著[13]。

Wnt信號(hào)途徑參與細(xì)胞信號(hào)啟動(dòng)、分子傳遞、靶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)等多個(gè)重要環(huán)節(jié)。Wnt信號(hào)通路對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移起到調(diào)節(jié)作用，已在多種腫瘤干細(xì)胞中得到證實(shí)[14]。目前針對(duì)胃癌的Wnt信號(hào)通路的研究主要集中在β-catenin、Wnt2和c-myc基因表達(dá)等幾個(gè)環(huán)節(jié)[15]。β-catenin和c-myc基因蛋白的過(guò)表達(dá)與胃癌和胃的癌前病變密切相關(guān)。Wnt信號(hào)通路在慢性胃炎患者及胃癌患者發(fā)病中具有重要意義[14]。慢性胃炎作為胃癌的發(fā)展過(guò)程中的重要一環(huán)，在疾病處于慢性胃炎階段對(duì)Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)進(jìn)行研究，可提早干預(yù)，預(yù)防炎癌轉(zhuǎn)化。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)胃組織病理學(xué)觀察表明升陽(yáng)益胃湯能有效治療胃腺體萎縮，減輕胃組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，效果比西藥組明顯。免疫熒光測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組胃組織β-catenin和Wnt2表達(dá)明顯增強(qiáng)；與模型組比較，升陽(yáng)益胃湯組胃組織β-catenin和Wnt2表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。表明β-catenin和Wnt2表達(dá)增加影響慢性胃炎的進(jìn)展，加重其炎癥反應(yīng)及腺體的萎縮；升陽(yáng)益胃湯有良好的調(diào)節(jié)β-catenin和Wnt2失調(diào)的作用，可以使其調(diào)節(jié)至正常水平，從而有效地治療慢性胃炎，并及時(shí)阻斷其“炎癌轉(zhuǎn)化”。

綜上，升陽(yáng)益胃湯能有效改善慢性胃炎小鼠胃組織病理變化，減輕胃組織炎癥反應(yīng)，并可以調(diào)節(jié)胃組織β-catenin和Wnt2表達(dá)。初步推斷升陽(yáng)益胃湯對(duì)慢性胃炎小鼠Wnt信號(hào)通路的有一定影響，為進(jìn)一步研究“炎癌轉(zhuǎn)化”的阻斷提供基礎(chǔ)。