安 莉，汪 紅，馬婧瑋，袁永亮，翟南南，鄭鷺飛，吳緒金,

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南鄭州 450002；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州 450052；3.SCIEX中國，北京 100015；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

鐵棍山藥（Dioscorea oppositeThunb. cv. Tiegun）為薯蕷科植物薯蕷的塊莖，分布于河南省武陟縣、溫縣等地的山藥品種，其性平味甘，健脾止瀉、補肺益腎，具有“補虛羸、除寒邪熱、補中益氣力、長肌肉、久服耳目聰明、輕身不饑、延年”等功效，屬山藥中的極品[1]。鐵棍山藥富含多糖、蛋白、脂類、黃酮、多酚類等多種活性成分，具有調(diào)節(jié)脾胃、增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用，兼有食用價值和藥用價值[2-3]。

除了鐵棍山藥的藥用飲片外，目前市場上也不斷涌現(xiàn)出以鐵棍山藥為原料制成的零食或保健品，如鐵棍山藥薯片、鐵棍山藥餅干、鐵棍山藥粉等。然而，無論是在直接食用或加工鐵棍山藥過程中，鐵棍山藥皮一般都直接削除丟棄，造成了極大的資源浪費。目前，關(guān)于鐵棍山藥皮的報道尚少，僅見對其所含部分成分的研究，如多糖[4]、黃酮類化合物的提取[5]以及多酚化合物的體外抗氧化作用[6]。這些研究僅關(guān)注單類化合物，對其所含化學(xué)成分的認(rèn)識不夠全面，無法反映其整體的化學(xué)成分特征。此外，鐵棍山藥皮藥用和營養(yǎng)價值尚不明確，這也嚴(yán)重阻礙了其再利用。因此，全面、系統(tǒng)識別鐵棍山藥皮所含的化學(xué)成分，并挖掘其相應(yīng)的分子機制，對于鐵棍山藥皮活性功能物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF-MS/MS）具有速度快、靈敏度高、分辨率高等特點[7]，根據(jù)化合物質(zhì)譜信息，結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)χ胁菟?、?fù)方制劑、天然產(chǎn)物等中的化學(xué)成分進行快速分離和鑒定。生物信息學(xué)是綜合運用系統(tǒng)生物學(xué)、計算機科學(xué)、信息技術(shù)和數(shù)學(xué)理論等技術(shù)方法的交叉學(xué)科[8]，能夠從中草藥、復(fù)方制劑、天然產(chǎn)物機制研究、復(fù)雜疾病治療等生命科學(xué)的海量數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)、挖掘、闡述其中所包含生物學(xué)意義[9]。

聯(lián)合UPLC-Q/TOF-MS/MS和生物信息學(xué)的方法越來越多地應(yīng)用于多成分多靶點多通路的機制研究[10-11]。本研究擬采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對鐵棍山藥皮中的化學(xué)成分進行定性識別，并在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)對其潛在的靶點進行預(yù)測和功能分析，探討鐵棍山藥皮化合物成分的藥用和營養(yǎng)價值，為鐵棍山藥皮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥皮 河南省溫縣鐵棍山藥的山藥皮；甲醇、乙腈 色譜級，美國EMD Millipore公司；甲酸 色譜級，美國Sigma公司。

Exion 20AD型超高效液相色譜儀、X500R QTOF型高分辨質(zhì)譜儀（SCIEX OS軟件） 美國SCIEX公司；ME204E電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Synthesis 超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；DW-HL398S超低溫冷藏冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將鐵棍山藥流水清洗干凈，晾干，削皮后即刻將皮置于-80 ℃環(huán)境中過夜冷凍，取出后迅速于冷凍干燥機內(nèi)-90 ℃真空低溫冷凍干燥，待完全干燥后制成鐵棍山藥皮凍干粉，過8號篩。稱取1.0 g，加入5 mL甲醇:水=1:1（v/v）超聲提取30 min，在10000 r/min的條件下離心10 min，吸取上清液進樣[12]。

1.2.2 色譜條件 Waters HSS T3色譜柱（100×3.0 mm，1.8 μm）；流動相：0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序為：0～1.0 min，3% B；1.0～10 min，3%～30% B；10～20 min，30%～99% B；20～26 min，99% B；26～26.1 min，99%～3% B；26.1～30 min，3% B。進樣盤溫度：15 ℃；流速：0.40 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電噴霧離子源ESI檢測，在正、負離子模式下進行樣品采集，開啟動態(tài)背景以扣除干擾。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：氣簾氣流（CUR）25 psi；霧化氣流速（GS1）50 psi；輔助氣流速（GS2）50 psi；離子源電壓（ISVF）5500/-4500 V；離子源溫度（TEM）500 ℃；捕獲電壓（DP）80 V；碰撞電壓（CE）35±15 V。一級質(zhì)譜m/z掃描范圍設(shè)為50～1300 Da，掃描累計時間0.25 s，選擇響應(yīng)最高的碎片進行二級掃描，m/z掃描范圍設(shè)為50～1000 Da，掃描累計時間0.1 s。

1.2.4 化合物鑒定 采用SCIEX OS軟件進行質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)的采集和處理，通過質(zhì)量準(zhǔn)確度、同位素豐度、二級譜庫確認(rèn)及保留時間等，根據(jù)SCIEX自建天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫SCIEX TCM Library自動進行峰提取和篩查，進一步根據(jù)獲得的質(zhì)譜信息結(jié)合參考文獻、有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[13]、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB：https://hmdb.ca/）[14]和植物活性分子數(shù)據(jù)庫（Collective Molecular Activities of Useful Plants:CMAUP）[15]進行鐵棍山藥皮中化合物的鑒定識別。

1.2.5 活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）將所鑒別的化合物成分進行口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和藥物相似度（drug-likeness，DL）的查找。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫分析平臺篩選標(biāo)準(zhǔn)[16]OB≥20%和DL≥0.1篩選出潛在活性成分。

1.2.6 鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的活性成分利用PubChem數(shù)據(jù)庫找到相應(yīng)的SMILES信 息，通 過SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），設(shè)定物種“Homo sapiens”進行檢索，選擇Probability值大于0的值，獲取其潛在的作用靶標(biāo)[17]，利用Cytoscape 3.8.2分析軟件構(gòu)建鐵棍山藥皮-化合物-靶點相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.7 潛在作用靶點功能富集分析 將1.2.6項下獲得的作用靶點，通過R軟件中的ClusterProfiler軟件包進行相關(guān)靶點的KEGG通路分析[18]，以P＜0.05為篩選條件，獲得鐵棍山藥皮中目標(biāo)化合物富集的相關(guān)通路，進而分析其藥理和營養(yǎng)作用機理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于UPLC-Q/TOF-MS/MS平臺的鐵棍山藥皮中化學(xué)成分識別

采用上述色譜和質(zhì)譜條件對鐵棍山藥皮提取物中的化學(xué)成分進行檢測，其正、負離子模式掃描下質(zhì)譜基峰離子流圖如圖1所示。利用SCIEX OS軟件擬合計算可能的分子式，結(jié)合本地SCIEX TCM Library數(shù)據(jù)庫對鐵棍山藥皮質(zhì)譜離子流圖匹配出的化合物進行前期推測，再根據(jù)參考文獻、CMAUP、PubChem、HMDB等數(shù)據(jù)庫提供的一級、二級離子信息等進行進一步確定，最終鑒別出33種化合物，其中酚酸類9種，黃酮類7種，氨基酸有機酸類5種，糖類2種及其他類10種，以上成分相關(guān)歸屬及鑒定信息見表1。

圖1 鐵棍山藥皮提取物在正離子模式和負離子模式下的基峰離子流圖Fig.1 Base peak intensity chromatograms of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel in positive and negative modes

表1 鐵棍山藥皮提取物中化學(xué)成分的鑒定Table 1 Identification of chemical composition of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

2.2 活性成分篩選

將鐵棍山藥皮中鑒別所獲得的化合物成分，根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫分析平臺篩選標(biāo)準(zhǔn)OB≥20%和DL≥0.1篩選出潛在活性成分10個，見表2。

表2 鐵棍山藥皮中通過OB和DL預(yù)測的10個活性成分Table 2 Ten active ingredients predicted by OB and DL in Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

2.3 潛在作用靶標(biāo)預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

進一步通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對獲得的10個化合物靶點進行預(yù)測，去掉重復(fù)基因名稱，共獲得348個潛在作用靶點。利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建出鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of Dioscorea opposita Thumb peel-compound-target network

網(wǎng)絡(luò)中連接度值表明此化合物或靶點的重要程度，化合物的連接度分析發(fā)現(xiàn)，10個化合物中芹菜素、金合歡素、甘草素、山藥素I、原花青素B1、腺苷、雙去甲基姜黃素和丁香酸葡萄糖苷這8個化合物的連接度值均在60以上，其中芹菜素、金合歡素和甘草素的連接度值均大于100（圖3A），上述化合物可能為鐵棍山藥皮中潛在發(fā)揮功效的重要化合物；碳酸酐酶2（CA2）、絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1（PIM1）、二肽基肽酶4（DPP4）、環(huán)加氧酶1（PTGS1）、碳酸酐酶9（CA9）、碳酸酐酶1（CA1）、雌激素受體α（ESR1）、環(huán)加氧酶 2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸1（PTPN1）為連接度排名前10的作用靶點（圖3B），其可能為鐵棍山藥皮作用的主要靶點。

圖3 網(wǎng)絡(luò)中重要化合物靶點數(shù)和作用的主要靶點Fig.3 Top ten important compounds and primary targets of the network

續(xù)表 1

2.4 潛在作用靶點KEGG功能富集分析

將獲得的潛在作用靶基因通過R軟件中的ClusterProfiler軟件包進行KEGG功能富集分析，其中富集程度最高且排名前10條重要代謝通路分別為：PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、癌癥蛋白多糖信號通路（Proteoglycans in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、前列腺癌（Prostate cancer）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、非小細胞肺癌通路（Non-small cell lung cancer）和胰腺癌通路（Pancreatic cancer），見圖4。

圖4 化合物靶點的KEGG通路分析（Top10）Fig.4 KEGG pathway analysis of compound targets （Top10）

KEGG通路富集分析顯示，鐵棍山藥皮活性成分對應(yīng)的通路主要集中在細胞信號通路、癌癥和代謝類疾病治療等方面。其中，在細胞信號通路上，分別有48和34個基因富集在PI3K-Akt信號通路和HIF-1信號通路；抗癌癥方面，分別有38、32、25、24和23個基因富集在癌癥蛋白多糖信號通路、前列腺癌通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、非小細胞肺癌通路和胰腺癌通路等通路上面；調(diào)節(jié)代謝系統(tǒng)方面，分別41、25和29個基因富集在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用信號通路和內(nèi)分泌抵抗通路。圖5展示了這些KEGG通路與靶基因之間的相互關(guān)系。

圖5 KEGG通路與靶基因相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.5 KEGG pathway and target gene correlation network

3 討論與結(jié)論

針對鐵棍山藥中化合物成分及其藥理活性的研究較多，相對而言，鐵棍山藥皮的相關(guān)研究報道較少[4-6]。本文利用UPLC-Q/TOF-MS/MS平臺，分析并鑒別出了鐵棍山藥皮中的33種化合物，為其成分的識別和潛在價值奠定了前期基礎(chǔ)；通過生物信息學(xué)分析方法，找出鐵棍山藥皮中發(fā)揮功效的關(guān)鍵化學(xué)成分，其中芹菜素、金合歡素、甘草素、去二甲氧基姜黃素、山藥素I等物質(zhì)具有良好的生物活性。如芹菜素具有抗炎、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、保護肝功能、抗動脈硬化和腦血栓、降壓和鎮(zhèn)靜抗焦慮等功效[29]，金

合歡素具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[30]，甘草素具有良好的抗癌活性和抗腫瘤作用[31]，去二甲氧基姜黃素具有抗細胞凋亡、抗氧化和抗炎作用[32]，山藥素I具有良好的抗炎作用[33]，由此可見，鐵棍山藥皮可能通過多成分共同發(fā)揮其藥用和營養(yǎng)價值。同時，這些功能成分的鑒別對于鐵棍山藥皮中營養(yǎng)與藥用功能物質(zhì)的開發(fā)和利用也有著重要的參考意義。

鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，鐵棍山藥皮具有多個作用靶點，其中重要潛在靶點包括癌癥腫瘤相關(guān)基因（PIM1）、治療糖尿病代謝相關(guān)基因（GSK3B、PTPN1、DPP4）、雌激素受體（ESR1）、環(huán)加氧酶（PTGS1、PTGS2）和多種碳酸酐酶（CA2、CA9、CA1）等，這些基因與癌癥腫瘤、糖尿病、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、細胞生長和增殖調(diào)控及代謝等密切相關(guān)，體現(xiàn)了鐵棍山藥皮多成分-多靶點系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用機制。研究將成分對應(yīng)的靶基因進行KEGG富集分析，明確了鐵棍山藥皮成分靶點對應(yīng)的疾病主要集中在腫瘤癌癥、細胞信號傳導(dǎo)、糖尿病及代謝類等相關(guān)途徑，這一發(fā)現(xiàn)也為藥物的進一步研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS分析技術(shù)進行了鐵棍山藥皮中化學(xué)成分的鑒別，通過生物信息學(xué)預(yù)測了潛在活性化合物具有的多種藥理活性，初步明確了鐵棍山藥皮具有的藥用和營養(yǎng)價值，但鐵棍山藥皮尚需進一步深入挖掘和研究。首先，對鐵棍山藥皮中化合物成分的提取工藝、定性和定量分析研究十分必要；其次，本文通過生物信息學(xué)技術(shù)建立的山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中，所涉及的重要化合物和重要靶點需深入研究；最后，鐵棍山藥皮的再利用過程，需要建立規(guī)范化流程，進而可以形成產(chǎn)品，有望作為保健品或者中醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用于人類疾病的預(yù)防和治療。由此可見，本研究為鐵棍山藥皮資源的有效利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)依據(jù)，也為進一步延長鐵棍山藥的產(chǎn)業(yè)鏈、提高其附加值提供了理論數(shù)據(jù)。