田楠楠, 馮蜜亞

(1.河北省衡水市人民醫(yī)院， 河北 衡 水 0530002.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院， 河北 石家莊 050000)

股骨頭壞死 ( osteonecrosis of femoral head，ON- FH) 為臨床骨科常見疾病，是股骨頭血供不足導(dǎo)致骨細(xì)胞死亡，股骨頭微結(jié)構(gòu)改變礙的疾病[1]。ON- FH具有致殘性，多發(fā)于中青年，發(fā)病原因與創(chuàng)傷骨折、激素性及酒精性相關(guān)[2]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ( human bone marrow mesenchymal stem cells， hMSCs) 是具有分化潛力的干細(xì)胞 可分化成多種細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等[3]。相關(guān)研究證實(shí)，在激素性股骨頭壞死中存在hMSCs活性異常，主要為股骨中出現(xiàn)hMSCs活性降低[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是具有促血管生成的作用，已經(jīng)應(yīng)用于血管化組織工程的研究中已經(jīng)取得了較好效果，但是與股骨頭壞死關(guān)聯(lián)還需要進(jìn)一步研究[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(Transforming growth factor,TGF-β2)屬于成骨細(xì)胞趨化因子，當(dāng)出現(xiàn)TGF-β2缺失后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重骨缺失?，F(xiàn)有研究通過慢病毒將TGF-β2過表達(dá)轉(zhuǎn)染至干細(xì)胞內(nèi)能夠有效改善骨缺損[6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是長(zhǎng)度約22nt的非編碼RNA，可發(fā)揮基因調(diào)控、細(xì)胞生物學(xué)行為具有重要調(diào)節(jié)作用。微小RNA-141(miR-141)屬于其中成員之一，在骨組織修復(fù)及成骨細(xì)胞活性中存在關(guān)聯(lián)，并經(jīng)文獻(xiàn)證實(shí)在激素性股骨頭壞死中表達(dá)升高[7]。本文通過探討miR-141對(duì)股骨頭壞死骨髓間質(zhì)干細(xì)胞活性及VEGF/TGF-β2蛋白的影響，為股骨頭壞死的臨床治療提供方向。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集及細(xì)胞提取:選取2020年4月至2021年4月期間進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的18例激素性股骨頭壞死患者及10例股骨頸骨折患者，均自愿參與并簽署知情同意書及經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。股骨頭壞死患者術(shù)前符合賓夕法尼亞大學(xué)分期IV～VI分期，所有患者均無感染病史，激素性股骨頭壞死患者均采用糖皮質(zhì)激素治療超過4周，于無菌條件下進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)過程中，提前用肝素處理注射器，手術(shù)過程中均抽取骨髓約5mL，放入抗凝的離心觀眾制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液共放入離心管中，3000r/min(離心半徑10cm)下分離10min，將離心管底部白膜層的單個(gè)核細(xì)胞放置另一個(gè)離心管中，棄上清液，用含15%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106/mL接種于培養(yǎng)瓶中在飽和濕度，5%的CO2及37℃中培養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器:試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基購自中國上海微科生物有限公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自中國上海素爾生物科技有限公司；噻唑藍(lán)MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；干細(xì)胞表面抗原CD44、CD45、CD13、CD14抗原均購自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人TGF-β2單克隆抗體均購自中國上海圻明生物科技有限公司；山羊抗兔IgG購自中國武漢純度生物科技有限公司；儀器：電子天平購自中國上海眾淵實(shí)業(yè)有限公司；TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)購自中國湖南湘瑞生物有限公司；倒置顯微鏡購自中國上海豫光儀器；凝膠成像系統(tǒng)及Western blot電泳系統(tǒng)均購自中國北京賽百奧科技有限公司；BriCyte E6流式細(xì)胞儀購自中國邁瑞醫(yī)療有限公司。

1.3原代細(xì)胞抗原檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞傳代取第3代MSCs，采用0.25%胰蛋白酶消化后采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞完全懸浮后采用PBS沖洗，在加入相關(guān)抗體CD44、CD45、CD13、CD14，4℃下避光孵育30min，PBS沖洗后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。顯微鏡下觀察原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，75%乙醇消毒，棄去舊的培養(yǎng)基，PBS洗滌三次，加入0.25%胰蛋白酶消化，生長(zhǎng)至90%時(shí)終止消化反應(yīng)，脫壁后，放入15mL的離心管中1000r/min，5min后，棄去上清液放入培養(yǎng)基中2～3d傳代。

1.4MSCs細(xì)胞干預(yù)及分組:PBS緩沖液將MSCs細(xì)胞株洗凈，重復(fù)3次，胰蛋白酶消化2min，離心15mL后，將數(shù)目為5×103細(xì)胞平鋪到6孔板中，融合率達(dá)到70%，采用無血清培養(yǎng)基按照3μL稀釋，在37℃下孵育20min，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000說明書操作，分別將miR-141siRNA、miR-141-siRNA-NC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株中，37.5℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。12h后將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，提取細(xì)胞RNA，采用qRT-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。分組：將MSCs細(xì)胞分為A組(股骨頸骨折患者h(yuǎn)MSCs細(xì)胞)、B組(激素性股骨頭壞死患者h(yuǎn)MSCs細(xì)胞)、C組(B組+hMSCs細(xì)胞+miR-141-siRNA-NC)、D組(B組++miR-141-siRNA)。

1.5MTT檢測(cè)各組hMSCs細(xì)胞存活率:各組hMSCs細(xì)胞接種在96孔板中，消化后，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞濃度0.6×104個(gè)/mL，均加入5mg/mL的MTT溶液20μL，培養(yǎng)24h、48h及72h后，然后吸棄培養(yǎng)液，再在每個(gè)孔中加入50μL DMSO，搖勻后放入490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)(OD值)，取3次平均值。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組hMSCs細(xì)胞凋亡:取2×105個(gè)/mL的hMSCs細(xì)胞懸液，PBS溶液予以洗滌，離心5min，運(yùn)用100μL結(jié)合緩沖液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，用5μL標(biāo)記FITC的AnnexinⅤ與5μL PI染色混勻，避光條件下，孵育15min后注入400μL結(jié)合緩沖液混勻，予以洗滌，次數(shù)3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7免疫印跡檢測(cè)hMSCs細(xì)胞VEGF、TGF-β2蛋白表達(dá):hMSCs移入孔6板中，細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/mL，PBS沖洗，加入150μL RIPA的裂解液，12000r/min離心15min后，放入樣孔中，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。PVDF膜TBS浸泡10min，反復(fù)PBS沖洗，5min/次，加入VEGF(1∶500)及TGF-β2(1∶1000)1抗和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶1000)，TBS沖洗3此后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5000)，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取圖象。

1.8QRC-PCR檢測(cè)hMSCs細(xì)胞miR-141、VEGF、TGF-β2相對(duì)表達(dá)量:hMSCs細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/mL，提取細(xì)胞中RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，分離后采用Trizol法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得反體系，條件為：42℃作用60min，72℃作用5min，4℃終點(diǎn)。每個(gè)細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95℃預(yù)作用3min，95℃作用5s，58℃退火，40個(gè)循環(huán)。見表1。

表1 引物序列

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因:從人類基因組DNA產(chǎn)生全長(zhǎng)VEGF-3′UTR,TGF-β2-3′UTR并通過退火合成的信號(hào)寡核苷酸產(chǎn)生突變體，DNA片段克隆到ph-TK載體，VEGF-3′UTR WT/TGF-β2-3′UTR WT為野生型，VEGF-3′UTR MUT/TGF-β2-3′UTR MUT為突變型，均轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內(nèi)參照。檢測(cè)細(xì)胞中VEGF、TGF-β2的熒光活性相對(duì)值。使用 Lipofectamine 2000 TM檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率在孢菌素酶活性的基礎(chǔ)上正常化。按照說明書，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒測(cè)量miR-141對(duì)VEGF、TGF-β2的表達(dá)活性的調(diào)控能力。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)hMSCs細(xì)胞表面抗原:hMSCs細(xì)胞表表面抗原CD44(86.33±3.02)%，CD13(90.25±2.55)%呈現(xiàn)高表達(dá)，CD14(0.89±0.15)%、CD45(0.33±0.05)%呈現(xiàn)低表達(dá)。

2.2hMSCs細(xì)胞形態(tài)比較:A為股骨骨折患者分離培養(yǎng)24h的hMSCs細(xì)胞出現(xiàn)少量貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘狀生長(zhǎng)，融合速度較快，呈現(xiàn)旋渦狀生長(zhǎng)；B為激素性股骨頭壞死患者離培養(yǎng)24h的hMSCs細(xì)胞數(shù)量較少，多數(shù)呈現(xiàn)呈梭形分布，見圖1。

圖1 股骨骨折和激素性股骨頭壞死hMSCs細(xì)胞形態(tài)

2.3RT-PCR檢測(cè)各組hMSCs中miR-141 mRNA表達(dá):與A組相比，B組細(xì)胞miR-141 mRNA升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組miR-141 mRNA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與C組相比，D組miR-141 mRNA降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組hMSCs中miR-141 mRNA表達(dá)注：與A組相比，aP<0.05；與B組相比，bP<0.05；與C組相比，cP<0.05

2.4MTT檢測(cè)各組hMSCs細(xì)胞存活:與A組相比，B組hMSCs細(xì)胞活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組24h、48h及72h hMSCs細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與C組相比，D組MSCs細(xì)胞24h、48h及72h 活性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 各組hMSCs細(xì)胞存活OD值(490nm)

圖3 各組hMSCs細(xì)胞存活OD值比較注：與A組相比，aP<0.05；與B組相比，bP<0.05；與C組相比，cP<0.05

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組hMSCs細(xì)胞凋亡率:A組、B組、C組及D組hMSCs細(xì)胞凋亡率分別為(4.23±0.33)、(20.73±1.20)、(19.43±1.16)及(14.76±0.80)，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=381.00，P<0.001)；與A組相比，B組hMSCs細(xì)胞凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組hMSCs細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與C組相比，D組hMSCs細(xì)胞凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組hMSCs細(xì)胞凋亡率比較(n=6)

2.6各組hMSCs細(xì)胞VEGF、TGF-β2蛋白水平比較:與A組相比，B組VEGF、TGF-β2蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組VEGF、TGF-β2蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與C組相比，D組VEGF、TGF-β2蛋白升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖5。

表3 各組hMSCs細(xì)胞VEGF TGF-β2蛋白水平比較

圖5 各組細(xì)胞VEGF、TGF-β2蛋白水平比較

2.7各組hMSCs細(xì)胞VEGF、TGF-β2mRNA比較:與A組相比，B組hMSCs細(xì)胞VEGF、TGF-β2mRNA降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組VEGF、TGF-β2mRNA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與C組相比，D組hMSCs細(xì)胞VEGF、TGF-β2mRNA升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組細(xì)胞VEGF TGF-β2 mRNA比較

2.8miR-141對(duì)VEGF、TGF-β2調(diào)控作用:為了明確miR-141相關(guān)VEGF、TGF-β2情況，使用生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-141與VEGF、TGF-β2由相互結(jié)合的序列，證明之間存在調(diào)控關(guān)系。為了驗(yàn)證miR-141相關(guān)VEGF、TGF-β2的3′UTR結(jié)合，我們將miR-141轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過抑制miR-141觀察對(duì)VEGF、TGF-β2的熒光活性變化，證實(shí)：miR-141-siRNA能夠上調(diào)VEGF、TGF-β2活性，miR-141-siRNA能與VEGF、TGF-β2的3′UTR特異性結(jié)合，見表5。

表5 miR-141對(duì)VEGF TGF-β2調(diào)控作用

3 討 論

hMSCs細(xì)胞屬于自我更新及分化較強(qiáng)的細(xì)胞，hMSCs可分化為成骨細(xì)胞及骨髓結(jié)締組織等對(duì)于改善骨損傷及加強(qiáng)軟骨修復(fù)具有重要作用[8]。hMSCs表明抗原CD44、CD13呈現(xiàn)陽性，CD14及CD45呈現(xiàn)陰性，利用流式細(xì)胞儀證實(shí)了股骨髖骨骨折及激素性股骨頭壞死中提取的hMSCs滿足實(shí)驗(yàn)需要。股骨頭壞死的誘發(fā)原因之一為長(zhǎng)期使用激素可導(dǎo)致機(jī)體過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPAPγ)升高可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞在骨髓中沉淀增加成脂分化紊亂進(jìn)一步抑制成骨細(xì)胞活性而降低骨修復(fù)[9]。因此，通過增加hMSCs活性抑制成脂分化及增加成骨細(xì)胞活性對(duì)于減少股骨頭壞死具有重要意義。

近些年隨著生物分子靶向技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)研究證實(shí)miRNAs與多種疾病發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。miRNAs廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其家族成員之間存在高度同源序列，可通過對(duì)靶向基因進(jìn)行完全和非完全的配對(duì)進(jìn)而發(fā)揮抑制翻譯、轉(zhuǎn)錄等作用[10]。早在2008年Kobayashi發(fā)現(xiàn)miRNAs與骨存在關(guān)系，并敲除了小鼠體內(nèi)內(nèi)切核酸酶Dicer后發(fā)現(xiàn)小鼠hMSCs細(xì)胞成骨分化能力消失，導(dǎo)致骨生成減少及骨密度降低，而Dicer屬于miRNA合成必需的一類酶類，說明miRNA在骨發(fā)育有重要作用[11]。miR-141是miRNAs家族成員之一，在骨質(zhì)疏松中miR-141-3p表達(dá)升高能夠充當(dāng)hMSCs活性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，沉默后可改善低骨量疾病[12]。目前，miR-141在股骨頭壞死中的研究暫無，但張文明等[13]等研究證實(shí)了miR-141在骨形成中也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)行hMSCs細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抑制miR-141表達(dá)可增加成骨細(xì)胞增殖及分化，認(rèn)為主要是通過調(diào)節(jié)Wnt靶基因而發(fā)揮作用。本文研究證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-141-siRNA能夠提高h(yuǎn)MSCs細(xì)胞存活，降低凋亡。沉默miR-141對(duì)hMSCs細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，主要是對(duì)成骨基因進(jìn)行調(diào)節(jié)而間接增加骨形成而降低對(duì)hMSCs細(xì)胞活性抑制作用。張志恒等[14]研究表明，miR-141的內(nèi)源性降低后可減少對(duì)同源轉(zhuǎn)錄因子5(DLX5)的靶向抑制表達(dá)升高可激活上調(diào)因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)而促進(jìn)成骨形成。張楚天等[15]研究表示，抑制miR-141可增加BMSCs成骨分化作用主要在于激活調(diào)控Dlx5/Runx2信號(hào)進(jìn)而發(fā)揮預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的。本文認(rèn)為抑制miR-141后可減少對(duì)VEGF及TGF-β2的抑制而增加hMSCs細(xì)胞進(jìn)而改善股骨頭壞死。

VEGF被稱為最有力的血管生長(zhǎng)因子，能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞分化而增加血管新生。從骨形成細(xì)胞水平，VEGF可增加hMSCs細(xì)胞聚集及分化而增加成骨細(xì)胞活性，可全身性及局部性調(diào)節(jié)骨形成。TGF-β2可影響血管生成而增加hMSCs細(xì)胞活性。在骨生長(zhǎng)及修復(fù)過程中TGF-β2及VEGF可相互影響而增加骨組織血管新生，并可直接作用與hMSCs細(xì)胞可增加其活性，提高分化功能而改善骨組織缺血。本文研究發(fā)現(xiàn)，在hMSCs細(xì)胞中抑制miR-141可增加TGF-β2及VEGF表達(dá)。據(jù)此我們推測(cè)抑制miR-141在hMSCs細(xì)胞調(diào)節(jié)可能是通過激活TGF-β2及VEGF實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種預(yù)測(cè)，我們將含有TGF-β2及VEGF的3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因與miR-141siRBA共轉(zhuǎn)染于hMSCs細(xì)胞中來證明其靶基因關(guān)系。驗(yàn)證miR-141對(duì)目的基因TGF-β2及VEGF的靶向作用。Choi S K[16]研究表示，miR-141的靶標(biāo)主要為MAPK1、VEGF-A、EGFR、YAP1、STAT4，分別來自Star Base和Target Scan，通過靶向上述指標(biāo)miR-141可促進(jìn)血管疾病發(fā)生發(fā)展。但是在股骨頭壞死hMSCs細(xì)胞的抑制miR-141對(duì)TGF-β2及VEGF作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本文存在一定局限性，miR-141對(duì)于TGF-β2及VEGF研究機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在單一性，今后應(yīng)豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，加強(qiáng)與其他單位合作，完善其作用機(jī)理，為股骨頭壞死臨床研究提供實(shí)踐基礎(chǔ)。綜上沉默miR-141能夠通過提高股骨頭壞死骨髓間質(zhì)干細(xì)胞活性，抑制凋亡發(fā)揮髓間質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)作用，研究機(jī)制可能與激活VEGF、TGF-β2活性相關(guān)。