鄭 玲, 陳 立, 王 月

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院， 湖北 襄陽 441021)

糖尿病腎病是由糖尿病患者長期血糖控制不佳引起的一種慢性并發(fā)癥，主要特征為腎臟微血管損傷、腎小球濾過率下降等，患者常伴有尿微量白蛋白增多、水腫、高血壓、貧血等臨床癥狀，影響正常生活[1,2]。目前研究指出，血流動力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等引起的腎小球濾過屏障破壞與糖尿病腎病密切相關(guān)[3]。蛋白尿與腎臟損傷相關(guān)，腎小球濾過率則與腎小球足細胞結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)。足細胞數(shù)量減少與壞死性凋亡相關(guān)，而壞死性凋亡途徑受TNF-α激活并與RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路密切相關(guān)[4]。現(xiàn)階段，糖尿病腎病的治療以降血糖、降血壓和控制飲食為主，但即使嚴(yán)格控制血糖和血壓，預(yù)后仍不理想[5]。所以研究糖尿病腎病的發(fā)病機制與新型藥物仍是研究人員的關(guān)注重點。中醫(yī)講，糖尿病腎病患者大多脾腎陽虛，新加腎元方是一種中藥方劑，方劑納入人參、炙黃芪、制附片、肉桂、淮山、熟地黃等多種中藥材，起到溫陽補腎效果[6]。本研究旨在探索新加腎元方中對糖尿病腎病起作用的活性成分，并分析新加腎元方對高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞損傷及RIPK1/RIPK3/MLKL通路的影響，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1動物:健康清潔級SD大鼠70只，雄性，6月齡，體質(zhì)量(230±10)g，許可證：SYXK(魯)2017-0001，合格證：37009200009757。飼養(yǎng)于12h光照/12h黑暗、溫度(25±1)℃、相對濕度(50±10)%的動物房內(nèi)，飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水。實驗前先適應(yīng)性喂養(yǎng)7d。

1.1.2藥物:新加腎元方：人參6g、炙黃芪15g、制附片10g、肉桂10g、淮山30g、熟地黃15g、懷牛膝15g、澤瀉10g、山茱萸10g、丹參10g、菟絲子10g、炙甘草3g，乏力者人參10g，大便溏稀者加茯苓15g，食欲差者加砂仁6g，畏寒肢冷制附子15g，藥物由襄陽市中心醫(yī)院藥房提供。

1.1.3試劑及儀器:鏈脲佐菌素；肌酐測定試劑盒；尿素氮測定試劑盒；TNF-α ELISA試劑盒；IL-6 ELISA試劑盒；One Touch Ⅱ型血糖儀及配套試紙，RM 2135輪轉(zhuǎn)型切片機，全自動生化分析儀，光學(xué)顯微鏡，垂直電泳儀。

1.2方 法

1.2.1造模、分組及給藥:從70只大鼠中隨機選12只為正常對照組，另58只建立模型：高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，按35mg/kg一次性腹腔注射給予1%的STZ溶液，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1周，尾靜脈采血測定隨機血糖，并隨機取5只大鼠進行腎組織病理學(xué)檢查，以大鼠隨機血糖≥16.7mmoL/L且腎組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變視為糖尿病腎病大鼠造模成功，共成功48只，隨機分為模型組，陽性對照組，新加腎元方低、高劑量組，各12只。藥物干預(yù)劑量如下：陽性對照組給予厄貝沙坦水溶液0.017g/kg灌胃，新加腎元方低、高劑量組分別給予0.72g/kg、1.44g/kg灌胃，正常對照組、模型組等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)12周。

1.2.2蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平:大鼠經(jīng)藥物干預(yù)12周后入代謝籠，取24h尿液，離心取上清，檢測尿液中蛋白含量；用藥結(jié)束，麻醉，取腹主動脈血，離心取血清，檢測其余指標(biāo)。

1.2.3HE染色觀察腎組織病理形態(tài):藥物干預(yù)結(jié)束后處死大鼠，部分腎組織-80℃冰箱保存待用，剩余部分于10%中性甲醛固定1d，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片。切片烘干后，二甲苯透明，無水乙醇處理5min，梯度乙醇各處理2min，清洗，蘇木素染色5min，清洗，0.5%鹽酸酒精分化，流水清洗返藍。0.5%伊紅染色2min，清洗1min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察。

1.2.4透射電鏡觀察腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)變化:步驟同上，透射電子顯微鏡下觀察腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.2.5TUNEL染色檢測腎組織細胞凋亡情況:切片脫蠟至水，加蛋白酶K(20μg/mL)，溫育，洗3次，5min/次，0.3%過氧化氫溶液室溫處理10min，洗3次，5min/次，加血清，溫育20min；加TdT反應(yīng)液，濕盒避光孵育45min，沖洗，加過氧化物酶標(biāo)記的抗體，濕盒避光30min，洗4次，5min/次，在組織切片上加顯色液，光鏡下觀察染色情況。

1.2.6ELISA檢測腎組織TNF-α、IL-6水平:取部分腎組織研磨，100mg腎組織/1mL預(yù)冷生理鹽水勻漿，勻漿液5000r/min離心15min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。TNF-α、IL-6單克隆抗體包被ELISA板，加標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品和生物素化的抗大鼠抗體，標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品中的待測因子與孔中生物素化的抗大鼠抗體及包被于酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，洗去游離成分，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素，經(jīng)底物顯色液顯色，測450nm OD值，繪制曲線求出TNF-α、IL-6濃度。

1.2.7WB檢測腎組織RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關(guān)蛋白表達:腎組織研磨，100mg腎組織/1mL預(yù)冷RIPA裂解液，勻漿液12000r/min離心15min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，各管上清加5×Loading buffer50μL，100℃煮沸15min，蛋白變性。10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉2h，TBST洗3次，抗RIPK1、RIPK3、MLKL、WT-1、β-actin抗體(1∶1000)孵育過夜，次日加入二抗1∶5000)，孵育1h，洗膜，檢測蛋白。

1.2.8新加腎元方中所含活性成分收集與篩選:中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)檢索新加腎元方的活性成分，篩選出活性成分較高的化合物，并查閱相關(guān)文獻作為補充。

1.2.9新加腎元方中不同活性成分與RIPK1/RIPK3/MLKL的分子對接:TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索方劑中活性成分的2D結(jié)構(gòu)，YASARA分子模擬軟件去H2O、加H質(zhì)子化和添加缺失原子，Cytoscape對人參、炙黃芪、肉桂、制附片的有效成分進行分析，PyMOL、AutoDock Vina等軟件對關(guān)鍵成分及主要靶點進行分子對接。

2 結(jié) 果

2.1大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平：與正常對照組相比，模型組大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平下降(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 大鼠蛋白尿血清肌酐和尿素氮水平

2.2大鼠腎組織病理形態(tài)：正常對照組腎組織形態(tài)正常，無異常改變；模型組大鼠腎小球基底膜變厚，系膜細胞增生，腎小管濁腫變性，腎間質(zhì)纖維化；陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組腎組織病理形態(tài)改變較模型組出現(xiàn)不同程度減輕，見圖1。

圖1 大鼠腎組織病理形態(tài)(×400)

2.3大鼠腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)變化：正常對照組大鼠腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)正常，無異常改變；模型組大鼠足細胞足突融合或消失，基底膜增厚；陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)病理形態(tài)改變較模型組出現(xiàn)不同程度改善，見圖2。

圖2 大鼠腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)變化(×7000)

2.4大鼠腎組織細胞凋亡情況：與正常對照組相比，模型組大鼠凋亡指數(shù)增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠凋亡指數(shù)下降(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2，圖3。

圖3 大鼠腎組織細胞凋亡情況(×200)

表2 大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)

2.5大鼠腎組織TNF-α、IL-6水平：與正常對照組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6水平增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠TNF-α、IL-6水平下降(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組TNF-α、IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 大鼠腎組織TNF-α IL-6水平

2.6大鼠腎組織RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關(guān)蛋白表達：與正常對照組相比，模型組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表達增加，WT-1蛋白表達下降(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表達下降，WT-1蛋白表達增加(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組RIPK1、RIPK3、MLKL、WT-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4、圖4。

圖4 RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關(guān)蛋白表達

表4 RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關(guān)蛋白表達

2.7新加腎元方的活性成分的篩選：新加腎元方的主要中藥成分為人參、炙黃芪、制附片、肉桂。在TCMSP中檢索人參、炙黃芪、肉桂所有成分數(shù)據(jù)，設(shè)置口服生物利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18，同時篩去無對應(yīng)靶點的成分，最終篩選出人參主要活性成分22個，炙黃芪主要活性成分20個、制附和肉桂主要活性成分0個，見表5。

表5 新加腎元方的活性成分的篩選

2.8分子對接分析：在TCMSP中檢索人參、炙黃芪、肉桂、制附片的有效成分并進行分析，根據(jù)degree結(jié)果得出新加腎元方中評分較高的活性成分有人參中的Celabenzine、炙黃芪中的Mairin。運用PyMOL、AutoDock Vina等軟件對關(guān)鍵成分及主要靶點進行分子對接，見圖5、圖6。同時對主要有效成分作用于RIPK1、RIPK3、MLKL的結(jié)合能進行了測定。RIPK1、RIPK3、MLKL的晶體結(jié)構(gòu)從uniprot中下載，序列號4NEU、7MX3、5KO1，分辨率為2.57、3.23、2.16，人參中的Celabenzine、炙黃芪中的Mairin與RIPK1、RIPK3、MLKL的結(jié)合能分別為-5.3、-6.42、-5.48和-5.39、-7.71、-5.41，由此可見新加腎元方中的核心有效成分炙黃芪中的Mairin與RIPK3形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高，見表6。

表6 新加腎元方中活性成分與靶點的結(jié)合能

圖5 新加腎元方中主要活性成分與RIPK1、RIPK3、MLKL作用的2d圖

圖6 新加腎元方中主要活性成分與RIPK1、RIPK3、MLKL的結(jié)合模式

3 討 論

研究表明[3]，2016年全世界大約有4.2億人群患者有糖尿病，這些糖尿病患者中絕大多數(shù)為2型糖尿病，典型表現(xiàn)為喝水多、吃飯多、尿多和體重減輕，該病目前無法治愈，確診后需終身服用藥物，因此嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。糖尿病易引發(fā)糖尿病腎病的并發(fā)癥，約20%左右的糖尿病患者患有糖尿病腎病，該病是多因素相互作用產(chǎn)生的結(jié)果，也是是造成終末期腎臟病的最主要原因，該病主要的病理行為包括腎小球濾過率增加、基底膜增厚和細胞外機制的積累，但具體的發(fā)病機制仍有待研究。研究指出，糖尿病腎病的發(fā)病與足細胞損傷密切相關(guān)，而壞死性凋亡是足細胞損傷與數(shù)量減少的重要原因，且壞死性凋亡為糖尿病腎損傷的一種重要細胞死亡模式，不依賴Caspase激活且具有典型壞死樣形態(tài)，其通過RIPK1/RIPK3/MLKL途徑進行調(diào)節(jié)[6]。新加腎元方是具有溫陽補腎、益氣養(yǎng)陰、健脾利尿效用的中藥方，而糖尿病腎病患者恰以脾腎陽虛型多見，因此，本研究旨在探索新加腎元方對高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞損傷及RIPK1/RIPK3/MLKL通路的影響，并分析其可能的作用機制。

中醫(yī)認為糖尿病腎病從氣陰兩虛到陰陽兩虛最終發(fā)展到氣血陰陽俱虛的過程，血瘀證貫穿疾病始終。所以治療糖尿病腎病應(yīng)溫陽補腎，益氣養(yǎng)陰，這對疾病的治療非常關(guān)鍵。新加腎元方是補腎益氣的中藥方劑，對糖尿病腎病亦具有治療效果，藥劑中人參大補元氣、補脾益肺、生津液、安神，為君藥；炙黃芪益氣補中滋補脾肺，制附片溫補陽氣，肉桂補元陽、暖脾胃、除積冷、通血脈，淮山補脾胃虧損、治氣虛衰弱，熟地黃滋陰、補血、治陰虛血少、腰膝痿弱，懷牛膝補肝益腎，為臣藥；澤瀉治腎炎水腫、腎盂腎炎、腸炎泄瀉、小便不利，山茱萸補血固精、補益肝腎、調(diào)氣、補虛、明目、強身，丹參可治腎孟腎炎，菟絲子補腎、肝、脾，為佐藥，炙甘草益氣滋陰，通陽復(fù)脈為使藥，上述藥物共用以達溫陽補腎、益氣養(yǎng)陰、健脾利尿的功效。在TCMSP檢索中發(fā)現(xiàn)新加腎元方中的人參主要活性成分22個，炙黃芪主要活性成分20個，這對糖尿病腎病的治療具有著重要意義。研究中也指出，新加腎元方干預(yù)后，糖尿病腎病大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平、凋亡指數(shù)、TNF-α、IL-6水平下降，腎組織病理改變及腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)改變得到緩解，這提示新加腎元方可改善糖尿病腎病大鼠腎功能，減輕腎組織損傷。

研究指出，壞死性凋亡是經(jīng)RIPK1/RIPK3/MLKL通路調(diào)節(jié)的糖尿病腎損傷的一種細胞死亡模式，且壞死性凋亡是腎小球足細胞損傷、減少的原因[7]。相關(guān)研究指出，TNF-α可激活TNFR1誘導(dǎo)RIPK1的表達，Caspase-8是凋亡、壞死性凋亡的關(guān)鍵，抑制Caspase-8激活，RIPK1去泛素化招募RIPK3，RIPK1/RIPK3復(fù)合招募并磷酸化MLKL，MLKL孔通過允許離子流入、細胞膨脹和膜溶解導(dǎo)致壞死性細胞死亡并誘發(fā)炎癥，所以，RIPK1與RIPK3形成復(fù)合體以及MLKL的磷酸化是壞死性凋亡的特異標(biāo)志，MLKL扮演壞死性凋亡執(zhí)行器角色，MLKL的N-端直接誘導(dǎo)膜破裂[8]。WT-1存在于足細胞核，是足細胞特異性標(biāo)志以反映足細胞損傷程度及數(shù)量。本實驗中，新加腎元方干預(yù)后，糖尿病腎病大鼠TNF-α，IL-6表達下降，RIPK1/RIPK3/MLKL蛋白表達下降、WT-1蛋白表達增加，這提示新加腎元方通過調(diào)控RIPK1/RIPK3/MLKL通路減輕腎損傷。

綜上所述，新加腎元方通過多成分、多靶點調(diào)控RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的表達水平，減輕腎組織病理損傷，改善腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)變化，抑制腎組織細胞凋亡，降低炎癥因子TNF-α、IL-6水平，緩解炎癥反應(yīng)，保護腎功能。