張 田， 任 丹

(1.陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院， 陜西 咸陽 7120002.湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤科， 湖北 武漢 430030)

肺癌是人類常見的癌癥之一，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要亞型[1]。環(huán)狀RNA(circRNA)在人NSCLC中存在差異表達，與臨床病理特征相關(guān)。circRNA BIRC6(circBIRC6)被報道在人NSCLC組織和細(xì)胞中上調(diào)，促進NSCLC發(fā)展[2]。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed death receptor ligand 1,PD-L1)是一種重要的免疫檢查點分子，在NSCLC中呈高表達，可與程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed death receptor 1,PD-1)相互作用介導(dǎo)癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[3,4]。然而，circRNA BIRC6在NSCLC進展中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的行為和機制尚未見報道。分化簇44(cluster of differentiation 44,CD44)是癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物，在NSCLC中表達上調(diào)，與NSCLC的不良預(yù)后相關(guān)[5,6]。研究顯示，CD44為NSCLC中PD-L1表達的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)因子[7]。因此，CD44是抑制NSCLC中PD-L1功能的潛在靶點。circRNA可作為miRNA“海綿”調(diào)控下游靶基因表達。據(jù)報道，miR-944在惡性腫瘤中發(fā)揮抑制或致癌功能。在NSCLC中miR-944下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制NSCLC細(xì)胞增殖[8,9]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-944為circBIRC6的潛在靶miRNA；且miR-944包含CD44的結(jié)合序列，表明circBIRC6、miR-944和CD44之間可能存在潛在聯(lián)系。因此，本研究旨在探討circBIRC6與miR-944以及miR-944與CD44之間的靶點相關(guān)性，以闡明這三個分子在NSCLC進展中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1細(xì)胞：人NSCLC細(xì)胞系(H1975、HCC827、H1650、H1299和A549)和人正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0298、CL-0094、CL-0166、CL-0165、CL-0016、CL-0496。A549和BEAS-2B細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而上述其他細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑與儀器：靶向circBIRC6的小分子干擾RNA(siRNA)(si-circBIRC6)、miR-944 mimic、miR-944 inhibitor及其陰性對照(si-NC、miR-NC、inhibitor-NC)由Ribobio(廣州，中國)合成。MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V)-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京Solarbio公司，M1020、CA1020)；人可溶性程序性死亡配體-1(sPD-L1)、干擾素-γ(INF-γ)、顆粒酶B、穿孔素ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml038111、ml077386、ml060098、ml063483)；EasySepTM人CD8+T細(xì)胞富集試劑盒(加拿大STEMCELL Technologies公司，19053)；Magna RIP試劑盒(美國Millipore公司，17-700)；兔源一抗CD44、PD-L1(英國Abcam公司，ab51037、ab205921)。ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；iMark680多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。

1.2方 法

1.2.1qRT-PCR檢測circBIRC6、miR-944和CD44 mRNA、PD-L1 mRNA表達：使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，使用SYBR Green Super Mix試劑盒進行PCR擴增。循環(huán)條件：95℃ 5min，然后是 95℃ 10s、60℃ 30s和 72℃ 20s的40個循環(huán)。GAPDH是circBIRC6和CD44 mRNA、PD-L1 mRNA的內(nèi)參，U6是miR-944的內(nèi)參。通過2-ΔΔCt法計算相對表達的倍數(shù)變化。引物序列見表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列

1.2.2Western blot檢測CD44、PD-L1蛋白表達：RIPA緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后，取等量總蛋白(30μg)通過10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜。封閉膜1 h后，在4℃下與一抗孵育1 h：抗CD44(1∶5,000)、PD-L1(1∶1,000)和GAPDH(稀釋度，1∶4,000)，然后與二抗(1∶5,000)在室溫下孵育1h。使用增強型ECL化學(xué)發(fā)光試劑使蛋白信號可視化，并使用Image J軟件檢測蛋白條帶的灰度值，目的蛋白與GAPDH灰度值的比值用于統(tǒng)計分析。

1.2.3轉(zhuǎn)染與分組：將A549細(xì)胞接種在6孔板中(1×105個細(xì)胞/孔)。孵育24h后，將si-circBIRC6、miR-944 inhibitor及其陰性對照si-NC、inhibitor-NC轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。實驗分為正常對照組(NC組，未轉(zhuǎn)染)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-circBIRC6組(轉(zhuǎn)染si-circBIRC6)、si-circBIRC6+anti-NC組(si-circBIRC6與inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染)、si-circBIRC6+anti-miR-944組(si-circBIRC6與miR-944 inhibitor共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染6h，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，qRT-PCR、Western blot檢測circBIRC6、miR-944和CD44、PD-L1的mRNA與蛋白表達水平。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖活性：將轉(zhuǎn)染48h后的各組A549細(xì)胞接種在96孔板中，密度為5000個細(xì)胞/100μL/孔。培養(yǎng)24、48和72h后，向每孔中加入10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將100μL/孔的二甲亞砜(DMSO)添加到細(xì)胞中溶解甲臜產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀在570nm處讀取每孔的光密度(OD)值。

1.2.5Transwell小室檢測細(xì)胞遷移、侵襲：將A549細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中。遷移實驗：將200μL(2×104個細(xì)胞)細(xì)胞懸液置于上室中，下室加入600μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育48h后，取出Transwell小室，用濕棉簽小心擦除上室底部膜表面細(xì)胞，侵入膜下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色，然后在倒置顯微鏡下計數(shù)。在侵襲檢測中，細(xì)胞接種在有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室，其余步驟同上。

1.2.6外周血CD8+T細(xì)胞的分離培養(yǎng)：使用EasySep人CD8+T細(xì)胞富集試劑盒從健康個體的全血中分離CD8+T細(xì)胞。在用于進一步實驗之前，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)分離的CD8+T細(xì)胞。

1.2.7臺盼藍染色測定共培養(yǎng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞活力：采用微孔2室(Transwell)共培養(yǎng)系統(tǒng)進行共培養(yǎng)。實驗分為對照組(Control組，CD8+T細(xì)胞單獨培養(yǎng))、NC組、si-NC組、si-circBIRC6組、si-circBIRC6+anti-NC組、si-circBIRC6+anti-miR-944組。除對照組外，其余各組上室接種相應(yīng)的轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，下室接種CD8+T細(xì)胞(可避免與A549細(xì)胞直接接觸)。共培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞并用0.4%臺盼藍溶液在室溫下染色20min，之后，用光學(xué)顯微鏡觀察和計數(shù)死藍細(xì)胞的數(shù)量。活細(xì)胞(無細(xì)胞質(zhì)熒光)，死細(xì)胞(藍色細(xì)胞質(zhì)熒光)。使用Image J軟件對10個隨機視野的臺盼藍陽性細(xì)胞進行量化，計算細(xì)胞活力(%)[(總細(xì)胞-死藍細(xì)胞)/總細(xì)胞×100%]。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞凋亡：共培養(yǎng)48h后，收集CD8+T細(xì)胞并重懸于500μL 1×結(jié)合緩沖液中，然后，將細(xì)胞在黑暗中用5μL Annexin-V-FITC和5μL PI染色15min。最后，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測CD8+T細(xì)胞凋亡率。

1.2.9ELISA法檢測細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10水平：共培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，在4℃下以1000×g離心10min取上清液。ELISA法檢測上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10水平。

1.2.10亞細(xì)胞分布分析：提取A549細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和核RNA，然后采用qRT-PCR測定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的circBIRC6水平。GAPDH和U6分別是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的內(nèi)參。

1.2.11雙熒光素酶報告(dual luciferase reporter assay,DLRA)基因檢測：使用StarBase數(shù)據(jù)庫(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測miR-944與circBIRC6和CD44之間的結(jié)合位點。將circBIRC6和CD44 mRNA的部分序列(包含與miR-944互補結(jié)合位點)克隆到pmirGLO載體中，命名為circBIRC6-WT和CD44-WT。通過定點誘變產(chǎn)生circBIRC6和CD44 mRNA的突變序列，并克隆到pmirGLO載體中以構(gòu)建circBIRC6-MUT和CD44-MUT。將A549細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔的密度接種到24孔板中，將熒光素酶重組質(zhì)粒與miR-944 mimic或?qū)φ?miR-NC)共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，獲得細(xì)胞裂解物，檢測熒光素酶活性。

1.2.12RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)測定：使用Magna RIP試劑盒結(jié)合qRT-PCR方法進行RIP測定來驗證circBIRC6與miR-944的結(jié)合。使用RIP裂解液裂解A549細(xì)胞，然后，將含有Argonaute-2抗體(Ago2)或免疫球蛋白G抗體(IgG)的瓊脂糖珠與細(xì)胞裂解物在4℃下一起孵育6h。IgG抗體為陰性對照。用蛋白酶K緩沖液處理珠子以去除蛋白質(zhì)。然后，使用TRIzol試劑提取免疫共沉淀的RNA，利用qRT-PCR檢測circBIRC6與miR-944的富集。

1.2.13RNA pull-down分析：A549細(xì)胞用50 nM的生物素標(biāo)記的野生型或突變型miR-944(Bio-miR-944-WT或Bio-miR-944-MUT)或陰性對照Bio-miR-NC轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收獲并裂解細(xì)胞。將M-28鏈霉親和素磁珠添加到細(xì)胞裂解物中，在4℃下孵育3h以分離生物素偶聯(lián)的RNA復(fù)合物。將珠子在洗滌緩沖液中洗滌，并使用qRT-PCR法純化和分析結(jié)合的RNA。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC細(xì)胞中circBIRC6、miR-944和CD44、PD-L1的表達：與人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞(A549、H1975、HCC827、H1650、H1299)中circBIRC6、CD44 mRNA和PD-L1 mRNA的表達升高(P<0.05)，miR-944表達降低(P<0.05)；其中，A549細(xì)胞中circBIRC6、CD44 mRNA和PD-L1 mRNA表達水平均高于其他NSCLC細(xì)胞，而miR-944表達較低(P<0.05)。見表2。因此，選擇A549細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

表2 不同NSCLC細(xì)胞系中circBIRC6 miR-944和CD44 PD-L1表達比較

2.2轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中circBIRC6、miR-944和CD44、PD-L1表達比較：與NC組、si-NC組相比，si-circBIRC6組circBIRC6、CD44和PD-L1的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)，miR-944水平升高(P<0.05)；與si-circBIRC6組、si-circBIRC6+anti-NC組相比，si-circBIRC6+anti-miR-944組CD44和PD-L1的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)，miR-944水平降低(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組細(xì)胞中CD44、PD-L1蛋白表達

表3 各組細(xì)胞中circBIRC6 miR-944和CD44 PD-L1表達比較

2.3敲低circBIRC6對A549細(xì)胞增殖活性的影響：在48和72 h時，與NC組、si-NC組相比，si-circBIRC6組A549細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)；與si-circBIRC6組、si-circBIRC6+anti-NC組相比，si-circBIRC6+anti-miR-944組A549細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組A549細(xì)胞增殖活性比較

2.4敲低circBIRC6對A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響：與NC組、si-NC組相比，si-circBIRC6組A549細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量減少(P<0.05)；與si-circBIRC6組、si-circBIRC6+anti-NC組相比，si-circBIRC6+anti-miR-944組A549細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量增加(P<0.05)。見圖2、表5。

圖2 各組A549細(xì)胞的遷移、侵襲能力(×200)

表5 各組A549細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量比較

2.5共培養(yǎng)系統(tǒng)中敲低circBIRC6的A549細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞活力的影響：與Control組相比，NC組共培養(yǎng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞活力降低，CD8+T細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與NC組相比，si-circBIRC6組共培養(yǎng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞活力升高，CD8+T細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與si-circBIRC6組、si-circBIRC6+anti-NC組相比，si-circBIRC6+anti-miR-944組共培養(yǎng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞活力降低，CD8+T細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞凋亡率

表6 共培養(yǎng)系統(tǒng)中敲低circBIRC6的A549細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞活力和凋亡率的影響

2.6共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中sPD-L1、IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素水平比較：與Control組相比，NC組共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中sPD-L1水平升高，IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素水平降低(P<0.05)；與NC組相比，si-circBIRC6組sPD-L1水平降低，IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素水平升高(P<0.05)；與si-circBIRC6組、si-circBIRC6+anti-NC組相比，si-circBIRC6+anti-miR-944組sPD-L1水平升高，IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素水平降低(P<0.05)。見表7。

表7 共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中sPD-L1 IFN-γ TNF-α 顆粒酶B和穿孔素水平比較

2.7circBIRC6在A549細(xì)胞中充當(dāng)miR-944海綿:亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，circBIRC6的比例較高，而在細(xì)胞核中circBIRC6的比例較低(圖4A)。通過StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-944被確定為circBIRC6的潛在靶標(biāo)(圖4B)。DLRA檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-944 mimic后，含有circBIRC6-WT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而含有circBIRC6-MUT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05，圖4C)。RIP檢測結(jié)果顯示，相對于IgG對照組，circBIRC6和miR-944在Ago2復(fù)合物中高度富集(圖4D)。生物素標(biāo)記的RNA pull-down結(jié)果顯示，circBIRC6被Bio-miR-944-WT拉下，而不是Bio-miR-944-MUT(圖4E)。

圖4 circBIRC6靶向調(diào)節(jié)miR-944表達A：qRT-PCR顯示circBIRC6在A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布；B：生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的circBIRC6和miR-944的靶向結(jié)合序列；C：用于驗證circBIRC6和miR-944之間關(guān)系的DLRA測定結(jié)果；D：RIP實驗證實circBIRC6和miR-944可以被Ago2抗體沉淀；E：使用qRT-PCR在由生物素化miR-944探針拉下的樣品中檢測circBIRC6富集；*P<0.05

2.8CD44為miR-944的靶標(biāo):使用StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-944的靶基因，發(fā)現(xiàn)CD44的3'UTR具有與miR-944互補的序列(圖5A)。DLRA結(jié)果顯示，與miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-944 mimic后，含CD44-WT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性降低(P<0.05)，含CD44-MUT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性未受顯著影響(P>0.05，圖5B)。

圖5 CD44是miR-944的靶標(biāo)A：生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的miR-944和CD44的靶向結(jié)合序列；B：用于驗證miR-944和CD44之間關(guān)系的DLRA測定結(jié)果；與miR-NC相比，*P<0.05

3 討 論

以往的研究表明circBIRC6[2]、CD44[5,6]和PD-L1[4]作為癌基因，而miR-944作為抑癌基因在NSCLC發(fā)展過程中發(fā)揮作用[8,9]。本研究結(jié)果顯示，circBIRC6在NSCLC細(xì)胞中的表達明顯升高，功能實驗證實，敲低circBIRC6可抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與以往的研究結(jié)果一致；表明circBIRC6可作為一種致癌基因，在NSCLC的惡性進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，circBIRC6是否在NSCLC的免疫逃逸中發(fā)揮作用仍有待探索。

先前的研究表明，miR-944在肺癌[10]的發(fā)生和進展中起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果顯示，circBIRC6和miR-944在NSCLC細(xì)胞中呈“一高一低”的表達趨勢，這與既往的發(fā)現(xiàn)一致。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示circBIRC6主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，可能作為特定miRNA的分子海綿調(diào)控NSCLC的發(fā)生。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-944與circBIRC6具有互補的結(jié)合位點。在A549細(xì)胞中敲低circBIRC6后，miR-944的表達增加。隨后，雙熒光素酶報告分析驗證了miR-944是circBIRC6的潛在靶基因；RIP和RNA pull-down檢測結(jié)果進一步證實circBIRC6和miR-944可以在A549細(xì)胞中結(jié)合；表明circBIRC6可以靶向并結(jié)合A549細(xì)胞中的miR-944，二者呈負(fù)調(diào)控。Liu等[8]人的體外實驗顯示，miR-944的過表達抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果表明，circBIRC6可能通過與miR-944競爭性結(jié)合來促進NSCLC的發(fā)展。

miR-944可與多種靶基因的3'-UTR相互作用。在這些靶基因中，與腫瘤免疫逃逸最相關(guān)的一個是CD44。據(jù)報道，CD44在NSCLC中表達上調(diào)，與NSCLC的不良預(yù)后相關(guān)[5,6]，并且CD44與肺癌中的PD-L1表達和免疫細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，是NSCLC中抑制PD-L1功能的潛在靶點[7,11]。一致的，在本研究中CD44和PD-L1在NSCLC細(xì)胞中表達升高，與miR-944表達趨勢相反。StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-944和CD44之間存在靶位點，表明CD44是miR-944的潛在靶標(biāo)。雙熒光素酶報告實驗進一步證實CD44是miR-944的靶基因。此外，circBIRC6的敲低降低了CD44 mRNA和蛋白表達水平，PD-L1的mRNA和蛋白水平也隨之降低，而miR-944的下調(diào)能夠逆轉(zhuǎn)circBIRC6的敲低對CD44 mRNA和蛋白表達水平的影響，提高了NSCLC細(xì)胞的增殖活力，增強了NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這些結(jié)果表明circBIRC6通過充當(dāng)miR-944的海綿上調(diào)癌基因CD44表達。

PD-L1在多種腫瘤中過表達，包括NSCLC[12]。PD-L1在正常組織中的存在有助于宿主免疫的穩(wěn)態(tài)，而在癌癥中，T細(xì)胞上的PD-1和腫瘤細(xì)胞上的PD-L1之間的相互作用，抑制抗原特異性CD8+T細(xì)胞的活化、擴增和效應(yīng)功能，并幫助癌細(xì)胞逃避免疫破壞[13]。sPD-L1是一種通過ELISA測量的血液中可溶形式的PD-L1[14]。為了闡明circBIRC6在NSCLC免疫逃逸中的作用與機制，本研究通過將A549細(xì)胞與CD8+T共培養(yǎng)在Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中，以避免直接的細(xì)胞間接觸。結(jié)果顯示，A549細(xì)胞分泌sPD-L1在共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞死亡，還降低了共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素的水平，表明NSCLC細(xì)胞通過在體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中分泌sPD-L1來滅活CD8+T細(xì)胞。而circBIRC6敲低的A549細(xì)胞減少了PD-L1的分泌，激活了共培養(yǎng)系統(tǒng)中的CD8+T，抑制了CD8+T細(xì)胞凋亡，且上調(diào)了共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素的水平。相反，在敲低circBIRC6的A549細(xì)胞中下調(diào)miR-944會使共培養(yǎng)系統(tǒng)中的CD8+T細(xì)胞失活；表明circBIRC6的敲低可下調(diào)PD-L1分泌，促進CD8+T細(xì)胞活化并分泌細(xì)胞因子，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

綜上，敲低circBIRC6可通過下調(diào)PD-L1的表達和分泌，激活腫瘤微環(huán)境中的CD8+T細(xì)胞，抑制NSCLC的免疫逃逸；其介導(dǎo)NSCLC免疫逃逸的機制可能與miR-944/CD44軸對PD-L1的調(diào)控作用有關(guān)。本研究表明circBIRC6是治療NSCLC的潛在靶點，并為circBIRC6提供了新的調(diào)控機制。然而，circBIRC6、miR-944和CD44在NSCLC患者中的表達水平及相關(guān)性尚需進一步的驗證；此外，尚需體內(nèi)實驗進一步驗證circBIRC6介導(dǎo)NSCLC免疫逃逸的分子機制，在未來的研究中將進行補充。