白 雪, 趙淑敏, 陳冉冉, 張晶晶

(內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

帕金森病(Parkinson Disease,PD)是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為主要病理表現(xiàn)，肌強(qiáng)直和行動(dòng)遲緩為核心運(yùn)動(dòng)癥狀，容易伴發(fā)認(rèn)知和精神障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀的慢性神經(jīng)退行性疾病，我國65歲以上人群患病率為1.7%[1]。抑郁癥(Major depressive disorder,MDD)是一類情緒低落、快感缺失、意志活動(dòng)減退等為主要癥狀的情緒障礙。認(rèn)知癥狀是MDD重要的3個(gè)維度之一，病程中持續(xù)存在損害[2]。PD患者常伴發(fā)抑郁和認(rèn)知損害癥狀，PD和MDD共病能夠降低患者自身運(yùn)動(dòng)功能認(rèn)知，更容易導(dǎo)致抽象推理等認(rèn)知功能缺陷，影響生活質(zhì)量。前額葉皮層Brodman9(BA9)區(qū)域在認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)和記憶相關(guān)功能中起著重要作用，此區(qū)域GABA能神經(jīng)傳遞缺陷參與MDD發(fā)病過程[3]。PD患者BA9區(qū)也存在神經(jīng)元損傷、路易小體形成、以及線粒體功能和蛋白折疊相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄組異常[4]，重復(fù)經(jīng)顱磁刺激前額葉背外側(cè)皮層的能夠改善PD患者伴發(fā)的MDD和認(rèn)知功能障礙[5]。因此，PD和MDD患者可能在BA9區(qū)域存在共同的分子病理變化。本研究中，我們利用生物信息學(xué)方法，分析PD和MDD患者在BA9區(qū)的共同差異基因及富集通路，挖掘關(guān)鍵致病基因，為PD和MDD共同發(fā)病機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1芯片數(shù)據(jù)來源與預(yù)處理:應(yīng)用在線GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE20168、GSE54567、GSE54568和GSE54570的芯片數(shù)據(jù)。其中，GSE20168數(shù)據(jù)使用GPL96平臺(tái)，包含14例PD患者和15例對(duì)照患者的BA9區(qū)域腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，PD和對(duì)照腦組織來源于美國馬里蘭大學(xué)腦組織庫、哥倫比亞大學(xué)紐約腦組織庫、弗吉尼亞州西洛杉磯脊髓液資源VA醫(yī)療中心、哈佛大學(xué)麥克萊恩醫(yī)院和邁阿密腦組織銀行。PD診斷標(biāo)準(zhǔn)為通過神經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)的PD患者，排除具有其他神經(jīng)病理疾病病例。對(duì)照組要求無腦部疾病病史。GSE54567數(shù)據(jù)使用GPL570平臺(tái)，包含14例MDD和14例對(duì)照患者的BA9區(qū)域腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；GSE54568數(shù)據(jù)使用GPL570平臺(tái)，包含15例MDD和15例對(duì)照患者的BA9區(qū)域轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；GSE54570數(shù)據(jù)使用GPL570平臺(tái)，包含15例MDD和15例對(duì)照患者的BA9區(qū)域轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；MDD和對(duì)照腦組織來源美國紐約州哥倫比亞大學(xué)精神病學(xué)研究所人類生物學(xué)中心腦庫，MDD入組標(biāo)準(zhǔn)：生前依據(jù)美國DSM-Ⅲ-R精神障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷重度抑郁暴力自殺病例。排除毒理學(xué)篩查中有精神藥物或非法藥物中毒，因長期痛苦的疾病死亡或內(nèi)科疾病猝死患者。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：沒有精神障礙，沒有使用藥物，由于自殺以外的原因且沒有長時(shí)間的痛苦的突然死亡患者。全部數(shù)據(jù)使用R軟件(版本號(hào)為3.6.3)調(diào)取limma包的normalizeBetweenArrays函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2差異表達(dá)基因提取及共表達(dá)差異基因分析:我們分別對(duì)4個(gè)芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析，首選調(diào)取limma包分析各個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因(Differential genes,DEGs)，使用P<0.05并logFC絕對(duì)值≥0.3作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，應(yīng)用ggplo2包繪制火山圖和熱圖。然后提取GSE20168、GSE54567、GSE54568和GSE54570數(shù)據(jù)DEGs并依據(jù)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)進(jìn)行韋恩圖分析，鑒定PD和MDD患者BA9區(qū)共表達(dá)差異基因。

1.3差異基因富集分析:基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫把基因的功能分成了三類：生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫可以了解目標(biāo)基因在CC.MF和BP三個(gè)層面上有什么關(guān)聯(lián)。京都基因百科全書和基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的PATHWAY數(shù)據(jù)庫整合了當(dāng)前在分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的知識(shí)。我們使用R語言調(diào)取clusterProfiler包(V3.14.3)分別對(duì)PD和MDD的上調(diào)或下調(diào)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。應(yīng)用p.adj<0.05且qvalue<0.2作為有意義富集條目的篩選條件進(jìn)行篩選，并對(duì)排名前10的GO條目和KEGG通路繪制氣泡圖展示。應(yīng)用GO plot包(V1.0.2)繪制和弦圖展示PD和MDD涉及的共同GO_BP條目及各自涉及DEGs。

1.4蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因分析:為了系統(tǒng)分析PD和MDD共表達(dá)DEGs生物學(xué)功能，我們將共表達(dá)DEGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(V11.5; https://string-db.org)分析表達(dá)蛋白質(zhì)間相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，互作評(píng)分設(shè)置為0.15。然后將String數(shù)據(jù)庫分析的蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入cytoscape軟件(V3.9.1)作圖展示蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用CytoHubba插件根據(jù)最大團(tuán)中心性(MCC)方法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行從高到低排序，確認(rèn)前10位關(guān)鍵DEGs。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)基因:GSE20168數(shù)據(jù)分析顯示：與對(duì)照組相比，PD患者存在12548個(gè)DEGs。MDD患者與對(duì)照組比較，GSE54567數(shù)據(jù)獲得21655個(gè)DEGs，GSE54568數(shù)據(jù)也有21655個(gè)DEGs，GSE54570數(shù)據(jù)獲得12548個(gè)DEGs。應(yīng)用P<0.05并logFC絕對(duì)值≥0.3作為條件篩選后，GSE20168數(shù)據(jù)中上調(diào)DEGs 736個(gè)，下調(diào)DEGs 829個(gè)；GSE54567數(shù)據(jù)中上調(diào)DEGs 13個(gè)，下調(diào)DEGs 14個(gè)；GSE54568數(shù)據(jù)中上調(diào)DEGs 64個(gè)，下調(diào)DEGs 82個(gè)；GSE54570數(shù)據(jù)中上調(diào)DEGs33個(gè)，下調(diào)DEGs34個(gè)(圖1A)。將四個(gè)數(shù)據(jù)集上調(diào)及下調(diào)DEGs分別進(jìn)行韋恩圖分析(圖1B)，結(jié)果顯示PD(GSE20168)和MDD(GSE54567、GSE54568、GSE54570)患者均上調(diào)的DEGs有21個(gè)，分別為：SLC35E1、ATP8B1、TSR1、ZNF721、RIOK3、FBXW12、ZNF160、POLR1B、CACNA1I、MZT2B、PGF、RP11-403P17.4、RPL23AP32、DBT、PRR11、USP34、LRRFIP1、DSERG1、DIP2A、AEBP1和DNAJB2基因，均表達(dá)減少的DEGs有13個(gè)，分別為：NPTX2、PCSK1、SST、PPP1CB、SEC22B、ENPP4、NME5、CAPZA2、GLRB、ITFG1、GLIPR1、TM6SF1和DUSP6基因。相應(yīng)結(jié)果使用熱圖展示(圖1C)。

圖1 DEGs表達(dá)可視化

A.火山圖展示各數(shù)據(jù)集DEGs：紅色的點(diǎn)代表高表達(dá)的DEGs，藍(lán)色的點(diǎn)代表低表達(dá)的DEGs，篩選條件：P<0.05并logFC絕對(duì)值≥0.3；B.韋恩圖分析PD和MDD共表達(dá)DEGs(左側(cè)：上調(diào)DEGs,右側(cè)：下調(diào)DEGs)；C.熱圖展示共表達(dá)DEGs水平(左側(cè)：PD樣本，右側(cè)：MDD樣本)，紅色代表高表達(dá)信號(hào)，藍(lán)色代表低表達(dá)信號(hào)。

2.2DEGs功能富集分析:PD患者上調(diào)的736個(gè)DEGs功能富集分析獲得有意義GO_BP條目188條，包括銅離子解毒、銅離子應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)銅離子的反應(yīng)等(圖2A，左側(cè))，GO_CC條目41條，GO_MF條目12條；獲得KEGG通路17條，前10位包括人乳頭瘤病毒感染、MAPK信號(hào)通路、胰島素抵抗、mTOR信號(hào)通路等(圖2A,右側(cè))。PD患者下調(diào)的829個(gè)DEGs功能富集分析發(fā)現(xiàn)有意義GO_BP條目383條，包括神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)節(jié)、樹突發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、囊泡定位、學(xué)習(xí)或記憶等(圖2B，左側(cè))，GO_CC條目164條，GO_MF條目56條，獲得KEGG通路41條，包括阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、肌萎縮側(cè)索硬化、亨廷頓病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)等通路(圖2B，右側(cè))，多數(shù)為神經(jīng)退行性疾病相關(guān)通路。MDD患者上調(diào)DEGs功能富集分析未獲得有意義BP、CC、MF條目及KEGG通路；下調(diào)DEGs功能富集分析獲得有意義GO_BP條目84條，包括認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶、細(xì)胞因子產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控等條目(圖2C)。

韋恩圖分析顯示PD與MDD下調(diào)DEGs有5個(gè)共同的GO_BP富集條目，分別是：GO:0007611(學(xué)習(xí)與記憶)、GO:0050890(認(rèn)知)、GO:0007612(學(xué)習(xí))、GO:0051384(對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng))、GO:0008306(聯(lián)想學(xué)習(xí))條目，提示PD和MDD均存在認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶及糖皮質(zhì)激素反應(yīng)通路功能障礙。這些共同條目在PD患者涉及的基因主要包括：NPTX2、ATXN1、PAFAH1B1、NLGN4X、VIP、PLCB1、BRINP1、FEN1、SHC3、CDK5、BHLHB9、SERPINF1、KRAS等45個(gè)基因(圖2E，左側(cè))，在MDD患者涉及的基因主要包括：NPTX2、ARC、CRH、CRHBP、HLA-DRA、X3CR1、FOS、JUN、CLDN5、BTG2等14個(gè)基因(圖2E，右側(cè))。

圖2 PD與MDD患者DEGs GO和KEGG富集分析可視化

A.PD患者上調(diào)DEGs在GO_BP條目(左側(cè))和KEGG(右側(cè))通路前10位；B.PD患者下調(diào)DEGs在GO_BP條目(左側(cè))和KEGG(右側(cè))富集通路前10位；C.MDD患者下調(diào)DEGs在GO_BP條目前10位；D.PD和MDD患者下調(diào)DEGs在GO_BP條目韋恩圖分析；E.左側(cè)：和弦圖展示PD患者共差異GO_BP條目及涉及DEGs，右側(cè)：和弦圖展示MDD患者共差異GO_BP條目及涉及DEGs。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵DEGs分析:為了了解PD和MDD共同DEGs表達(dá)蛋白間相互作用及鑒定關(guān)鍵基因，我們使用在線工具String及cytoscape軟件構(gòu)建了34個(gè)共同DEGs表達(dá)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3A)，進(jìn)一步使用CytoHubba插件分析了PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10個(gè)關(guān)鍵DEGs，關(guān)鍵程度從高到低排序依次為NPTX2、PCSK1、SLC35E1、ATP8B1、DUSP6、SST、TSR1、SEC22B、PPP1CB、ZNF721基因(圖3B)。在這些基因中，NPTX2、PCSK1、DUSP6、SST、PPP1CB基因在PD和MDD患者BA9區(qū)域均顯著表達(dá)下調(diào)(圖3C,3D，P<0.05)。

圖3 PD和MDD共同DEGs PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因分析A.PD和MDD共同DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；B.關(guān)鍵DEGs的PPI；C.PD患者關(guān)鍵下調(diào)DEGs表達(dá)箱圖；D.MDD患者關(guān)鍵下調(diào)DEGs表達(dá)箱圖，*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

MDD是PD的常見伴發(fā)疾病，并且越來越多證據(jù)顯示MDD患者更容易患PD[1]。PD和MDD患者均會(huì)出現(xiàn)前額葉病理變化及認(rèn)知功能障礙，我們推測(cè)前額葉認(rèn)知相關(guān)通路異?？赡苁荘D和MDD共同的致病基礎(chǔ)。在本研究中，我們應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫中PD和MDD患者BA9區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生信分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD和MDD患者前額葉BA9區(qū)域存在34個(gè)共同的DEGs,其中上調(diào)21個(gè)，下調(diào)13個(gè)。DEGs功能富集分析顯示PD和MDD存在5個(gè)共同的GO_BP條目，主要與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶有關(guān)。進(jìn)一步的PPI網(wǎng)絡(luò)作圖及關(guān)鍵基因分析顯示NPTX2、PCSK1、DUSP6、SST、PPP1CB基因表達(dá)減少可能是PD和MDD在基因表達(dá)層面共同的改變。

人類前額葉整合來自眾多輸入結(jié)構(gòu)的信息，并通過與其他皮層和皮層下區(qū)域的連接將更新的信息匯聚到輸出結(jié)構(gòu)，發(fā)揮認(rèn)知過程、情緒調(diào)節(jié)、動(dòng)機(jī)和社交能力。分子影像研究發(fā)現(xiàn)PD早期前額葉區(qū)域多巴胺攝取增加，但在疾病晚期中外側(cè)和內(nèi)側(cè)前額葉多巴胺和D2受體明顯減少，患有抑郁癥的PD患者左側(cè)背外側(cè)前額葉皮層活動(dòng)顯著降低，且內(nèi)側(cè)額葉網(wǎng)絡(luò)的失活與認(rèn)知損傷相關(guān)[6]，恢復(fù)內(nèi)側(cè)前額葉皮層的突觸可塑性能夠改善帕金森病小鼠模型抑郁樣行為[7]。因此，深入研究PD和MDD患者前額葉區(qū)域分子病理改變對(duì)于理解PD合并MDD的發(fā)病機(jī)制和制定治療策略具有重要意義。我們的研究發(fā)現(xiàn)PD和MDD患者在前額葉BA9區(qū)存在共同的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶功能相關(guān)條目及相應(yīng)DEGs，說明前額葉區(qū)域認(rèn)知相關(guān)基因表達(dá)改變可能是PD和MDD患者共同的分子病理基礎(chǔ)。約20%～33%的PD患者在診斷時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)輕度認(rèn)知障礙，高達(dá)60%～80%的PD患者在12年內(nèi)進(jìn)展為帕金森癡呆。MDD同樣可導(dǎo)致前額葉抑制及認(rèn)知靈活性受損，出現(xiàn)認(rèn)知中不靈活的負(fù)面偏見，包括僵化的負(fù)面信念等。20～50%的MDD患者伴有認(rèn)知障礙，經(jīng)常導(dǎo)致患者對(duì)認(rèn)知功能惡化的抱怨，而認(rèn)知缺陷導(dǎo)致對(duì)抑郁的抱怨。因此，前額葉區(qū)域認(rèn)知相關(guān)基因的表達(dá)變化也可能是PD容易伴發(fā)MDD及癡呆的原因。

目前，已知的PD和MMD共同相關(guān)基因極少，有研究報(bào)道國人Tef、5HTR1A、SLC6A15和TPH2單核苷酸多態(tài)性改變可能與PD伴發(fā)MDD相關(guān)，這些基因均與5羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)合成、調(diào)控及代謝相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)編碼神經(jīng)元五聚體蛋白Ⅱ的NPTX2基因在PD和MDD的BA區(qū)域均表達(dá)減少，而該基因主要參與γ氨基丁酸(GABA)信號(hào)調(diào)節(jié)，在神經(jīng)元激活和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)下，主要神經(jīng)元突觸前表達(dá)釋放NPTX2蛋白，調(diào)節(jié)其和GABA能中間神經(jīng)元之間的興奮性突觸傳遞，較低的NPTX2水平能夠降低GABA能抑制信號(hào)傳導(dǎo)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)PD患者BA9區(qū)域NPTX2表達(dá)減少與既往研究不一致，既往全基因組表達(dá)芯片研究發(fā)現(xiàn)NPTX2在PD患者黑質(zhì)和大腦皮層路易小體內(nèi)表達(dá)上調(diào)[9]，我們認(rèn)為這可能與PD病程及腦組織取材部位不同有關(guān)，因?yàn)橥瑸棣镣挥|核蛋白相關(guān)疾病，路易體癡呆患者腦脊液中NPTX2表達(dá)減少且與α突觸核蛋白水平及視覺空間域認(rèn)知下降有關(guān)，該結(jié)果支持我們的發(fā)現(xiàn)[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示NPTX2表達(dá)減少能夠?qū)е滦∈笠钟魳影Y狀及海馬區(qū)域炎癥反應(yīng)激活[8]。α突觸核蛋白在多巴神經(jīng)元內(nèi)異常聚集是PD的重要病理表現(xiàn)，我們認(rèn)為異常聚集α突觸核蛋白可能促進(jìn)PD患者神經(jīng)元突觸喪失和功能減少，繼而NPTX2表達(dá)減少，導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路激活和腦內(nèi)炎癥反應(yīng)過渡激活，從而出現(xiàn)抑郁癥狀，NPTX2表達(dá)變化與PD合并MDD的關(guān)系值得深入研究。

我們還發(fā)現(xiàn)BA9區(qū)PCSK1、DUSP6、SST、PPP1CB基因表達(dá)降低在PD和MDD同時(shí)存在，PCSK1是中樞黑皮質(zhì)素系統(tǒng)成分阿片黑皮質(zhì)素原(POMC)的重要表達(dá)調(diào)控基因，PCSK1缺失導(dǎo)致POMC不能剪接為促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和α-黑色素細(xì)胞刺激素(α-MSH)，參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、能量平衡、免疫調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)[11],而應(yīng)激障礙、能量平衡和免疫調(diào)節(jié)異常均是PD和MDD發(fā)病的重要機(jī)制。DUSP6基因編碼的雙特異性磷酸酶6是蛋白酪氨酸磷酸酶亞家族的成員，可以使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2去磷酸化，從而調(diào)節(jié)信號(hào)并影響細(xì)胞氧化應(yīng)激、增殖、分化和凋亡，下調(diào)DUSP6誘導(dǎo)錐體神經(jīng)元興奮性和應(yīng)激敏感性，增加DUSP6表達(dá)能夠減輕六羥基多巴對(duì)多巴胺神經(jīng)元的損傷。SST基因編碼生長抑素，能夠調(diào)控GABA神經(jīng)元異質(zhì)性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)退行性疾病和精神疾病表達(dá)較低，包括PD和MDD[12]。PPP1CB基因可編碼蛋白磷酸酶(PP1)的一個(gè)亞基，PP1是重要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，與蛋白激酶作用相反，使蛋白脫磷酸化，參與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[13],而晝夜節(jié)律異常是PD、MDD和認(rèn)知障礙患者常見癥狀。上述這些基因可能參與了PD和MDD在前額葉共同的發(fā)病分子機(jī)制。

綜上，雖然我們的研究尚缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但仍能為PD和MDD共同發(fā)病分子機(jī)制研究提供重要線索，前額葉BA9區(qū)域認(rèn)知通路功能障礙及NPTX2等關(guān)鍵基因表達(dá)減少可能是PD和MDD共同的分子病理。