任 松，楊林青，潘龍飛，田紅衛(wèi)

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科四病區(qū)，西安 710004；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院生物診斷治療國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心；3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科；*通訊作者,E-mail:rensong1982@126.com)

肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1]。肝癌在我國(guó)是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[2]。肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的90%[3]。肝癌早期缺乏明顯的癥狀，導(dǎo)致診斷時(shí)多為晚期，晚期患者的中位生存率僅為1～1.5年[4-6]。現(xiàn)有的治療方法對(duì)晚期肝癌的治療效果不佳，因此我國(guó)肝癌的整體5年生存率僅為10.1%[7]。為提高肝癌治療效果，需開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)。

microRNA作為治療靶點(diǎn)是目前肝癌研究中最有前景的方向之一[8-10]。microRNA是一類大小為19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默[11]。microRNA與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。在肝癌中也發(fā)現(xiàn)microRNA的失調(diào)廣泛涉及抑癌基因的失活和癌基因的激活[10]。miR-143-5p在胰腺癌和胃癌中低表達(dá)[13,14]，但在肝癌中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了miR-143-5p在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平及其作用，為肝癌治療提供可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細(xì)胞HL-7702和肝癌細(xì)胞(BEL-7402、HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H和Hep3B)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。miR-143-5p mimics、陰性對(duì)照mimics-NC、AGR2小分子干擾RNA(si-AGR2)和陰性對(duì)照si-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。甲基噻唑基四唑(MTT)試劑盒購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄酶PCR試劑盒和miR-X miRNA qRT-PCR TB Green購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物由日本TaKaRa公司合成。一抗兔抗人抗體Bax、Caspase-3和Bcl-2抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，二抗山羊抗兔抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

按照Lipofectamine2000說(shuō)明書，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2分別轉(zhuǎn)染mimics-NC和miR-143-5p mimics，命名為mimics-NC組和miR-143-5p mimics組。采用MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分別檢測(cè)mimics-NC組和miR-143-5p mimics組細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、凋亡率和凋亡相關(guān)基因(Bax、Caspase-3和Bcl-2)的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)mimics-NC組和miR-143-5p mimics組的熒光素酶活性。qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)mimics-NC組和miR-143-5p mimics組AGR2的mRNA和蛋白表達(dá)。

再將肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2分別轉(zhuǎn)染si-NC和si-AGR2，命名為si-NC組和si-AGR2組。采用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)si-NC組和si-AGR2組細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力和凋亡率。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2按照1.2所述進(jìn)行分組，將各組肝癌細(xì)胞接種在96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中。在第1，2，3，4，5天于每孔中加入MTT試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜低速震蕩使其溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光值。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)RNA表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞HL-7702和肝癌細(xì)胞(BEL-7402、HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H和Hep3B)中的miR-143-5p表達(dá)。再采用qRT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2中mimics-NC組和miR-143-5p mimics組AGR2的mRNA表達(dá)。使用Trizol法提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。U6作為miR-143-5p內(nèi)參照，GAPDH作為AGR2內(nèi)參照。miR-143-5p引物上游:5′-GGTGCAGTGCTGCATCT-3′，下游:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。AGR2引物上游:5′-ATGGAGAAAATTCCAGTG-3′，下游:5′-TTACAATTCAGTCTTCAG-3′；U6引物上游:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′，下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；GAPDH引物上游:5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，下游:5′-ACCAGGCGCCCAATACG-3′。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè)Bax、Caspase-3、Bcl-2和AGR2蛋白表達(dá)

將肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2按照1.2所述進(jìn)行分組。采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。將等量的蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行電泳。再行轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入封閉液中封閉1.5 h。加入一抗Bax(1 ∶500)、Caspase-3(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)和AGR2(1 ∶200)，在4 ℃靜置過(guò)夜。洗膜后再加入二抗，置于37 ℃孵育2 h。再洗膜，使用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2按照1.2所述進(jìn)行分組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組肝癌細(xì)胞，采用胰酶消化和反復(fù)吹打成單個(gè)細(xì)胞。接種于六孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。用多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后再用結(jié)晶紫染色15 min。清洗染色液后照相?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2按照1.2所述進(jìn)行分組。將各組細(xì)胞收集到離心管內(nèi)，用PBS洗滌2次并離心。加入結(jié)合緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加5 μl Annexin Ⅴ/FITC避光孵育5 min。再加5 μl碘化丙錠溶液(PI)和400 μl PBS。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-143-5p的靶基因

運(yùn)用靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站RNA22預(yù)測(cè)miR-143-5p可能結(jié)合的靶基因。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)靶基因

構(gòu)建靶基因AGR2的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體，將它們分別與mimics-NC或miR-143-5p mimics分別轉(zhuǎn)染到BEL-7402和HepG2細(xì)胞中，分為mimics-NC組和miR-143-5p mimics組。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶活性。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)處理軟件，兩組之間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組之間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-143-5p在正常肝細(xì)胞HL-7702和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，肝癌細(xì)胞BEL-7402、HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H和Hep3B的miR-143-5p表達(dá)均明顯下降(P<0.01，見(jiàn)圖1)。

與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，**P<0.01圖1 qRT-PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞HL-7702與肝癌細(xì)胞中miR-143-5p表達(dá)Figure 1 Expression of miR-143-5p in normal hepatocytes HL-7702 and hepatocellular carcinoma cells by qRT-PCR

2.2 過(guò)表達(dá)miR-143-5p抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2增殖

與mimics-NC組相比，miR-143-5p mimics組肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2細(xì)胞中miR-143-5p表達(dá)水平明顯上升(P<0.01，見(jiàn)圖2)，表明轉(zhuǎn)染成功。

與mimics-NC組相比，**P<0.01圖2 過(guò)表達(dá)miR-143-5p抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2的增殖Figure 2 Overexpression of miR-143-5p inhibits proliferation of BEL-7402 and HepG2 cells

與mimics-NC組相比，miR-143-5p mimics組BEL-7402和HepG2的細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力明顯下降(P<0.01，見(jiàn)圖2，3)。

與mimics-NC組相比，**P<0.01圖3 過(guò)表達(dá)miR-143-5p抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2的克隆形成能力Figure 3 Overexpression of miR-143-5p inhibits clone formation ability of BEL-7402 and HepG2 cells

2.3 過(guò)表達(dá)miR-143-5p促進(jìn)肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2凋亡

與mimics-NC組相比，miR-143-5p mimics組BEL-7402和HepG2細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01，見(jiàn)圖4)；與mimics-NC組相比，miR-143-5p mimics組凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)明顯上升(P<0.01，見(jiàn)圖5)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.01，見(jiàn)圖5)。

與mimics-NC組相比，**P<0.01圖4 過(guò)表達(dá)miR-143-5p促進(jìn)肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2的凋亡Figure 4 Overexpression of miR-143-5p promotes apoptosis of BEL-7402 and HepG2 cells

與mimics-NC組相比，**P<0.01圖5 Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2中mimics-NC組和miR-143-5p mimics組Bax、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)Figure 5 Expression of Bax, Caspase-3 and Bcl-2 in BEL-7402 and HepG2 cells in mimics-NC group and miR-143-5p mimics group by Western blot

2.4 miR-143-5p靶向調(diào)控AGR2基因

通過(guò)RNA22網(wǎng)站預(yù)測(cè)基因AGR2與miR-143-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，可能是miR-143-5p靶基因(見(jiàn)圖6)。在肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)顯示，與共轉(zhuǎn)染野生型AGR2質(zhì)粒的mimics-NC組相比，共轉(zhuǎn)染野生型AGR2質(zhì)粒的miR-143-5p mimics組熒光素酶活性明顯降低(P<0.01，見(jiàn)圖6)，表明AGR2是miR-143-5p的靶基因。

與mimics-NC組相比，**P<0.01B.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143-5p與AGR2的靶向作用關(guān)系圖6 肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2細(xì)胞中miR-143-5p靶向調(diào)控靶基因AGR2表達(dá)Figure 6 MiR-143-5p targetedly regulates AGR2 expression in BEL-7402 and HepG2 cells

在肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2細(xì)胞中，與mimics-NC組相比，miR-143-5p mimics組AGR2的mRNA的水平明顯下降(P<0.01)，AGR2的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01,見(jiàn)圖7)。

圖7 過(guò)表達(dá)miR-143-5p抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2中AGR2的表達(dá)Figure 7 Overexpression of miR-143-5p inhibits expression of AGR2 in BEL-7402 and HepG2 cells

2.5 沉默AGR2基因表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡

肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2轉(zhuǎn)染si-NC和si-AGR2后，si-AGR2組AGR2表達(dá)與si-NC組相比明顯下降(P<0.01，見(jiàn)圖8)，表明轉(zhuǎn)染成功。

與si-NC組相比，si-AGR2組BEL-7402和HepG2細(xì)胞增殖能力(P<0.01，見(jiàn)圖8)和克隆形成能力明顯下降(P<0.01，見(jiàn)圖9)。與si-NC組相比，si-AGR2組細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01，見(jiàn)圖10)。

圖8 沉默AGR2表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2增殖Figure 8 Silencing of AGR2 inhibits proliferation of BEL-7402 and HepG2 cells

與si-NC組相比，**P<0.01圖9 沉默AGR2表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2的克隆形成能力Figure 9 Silencing of AGR2 inhibits clone formation ability of BEL-7402 and HepG2 cells

與si-NC組相比，**P<0.01圖10 沉默AGR2表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2凋亡Figure 10 Silencing of AGR2 promotes apoptosis of BEL-7402 and HepG2 cells

3 討論

眾多microRNA在肝癌中表達(dá)失調(diào)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[8]。miR-21、miR-221和miR-222在肝癌中過(guò)度表達(dá)，通過(guò)負(fù)調(diào)控肝癌中的腫瘤抑制蛋白編碼基因來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15-17]。miR-122、miR-125b、miR-139、miR-101和let-7等microRNA在肝癌中表達(dá)下調(diào)，它們通過(guò)抑制肝癌的癌基因發(fā)揮抑制腫瘤作用[18-21]。microRNA已成為肝癌治療最有希望的靶點(diǎn)之一。

我們的研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2中miR-143-5p表達(dá)下降。過(guò)表達(dá)miR-143-5p可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，降低Bcl-2表達(dá)，升高Bax和Caspase-3的表達(dá)。表明miR-143-5p可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax和Caspase-3促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。其他研究也發(fā)現(xiàn)，miR-143-5p在胰腺癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-143-5p表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡和自噬[13]。miR-143-5p在多個(gè)胃癌細(xì)胞系中顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-143-5p可以抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[14]。miR-143-5p的過(guò)度表達(dá)可通過(guò)調(diào)控ELK1抑制宮頸細(xì)胞周期、增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡[22]。膽囊癌組織中miR-143-5p的下降與腫瘤大小、TNM分期及其生存率密切相關(guān)[23]。

我們通過(guò)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示AGR2可能是miR-143-5p的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)了AGR2為miR-143-5p的直接靶基因。過(guò)表達(dá)miR-143-5p可抑制AGR2的表達(dá)，進(jìn)一步表明了miR-143-5p可與AGR2 mRNA結(jié)合。抑制AGR2的表達(dá)，可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。提示miR-143-5p可能通過(guò)靶向AGR2調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。miR-143-5p靶向調(diào)控AGR2還需挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。AGR2是一種癌基因，在各種癌癥中普遍高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著決定性的作用[24,25]。AGR2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)了肝癌細(xì)胞體外的增殖、遷移、侵襲能力和裸鼠模型體內(nèi)的侵襲性[26,27]。高表達(dá)的AGR2通過(guò)激活ERK/AKT促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡[28]。AGR2在結(jié)腸癌干細(xì)胞高表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞成球能力，并且和結(jié)腸癌患者生存率密切相關(guān)[29]。AGR2水平升高可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，且AGR2表達(dá)升高的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后較差[30]。

綜上所述，上調(diào)miR-143-5p表達(dá)可能通過(guò)靶向抑制AGR2的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡，miR-143-5p有可能成為治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。肝癌細(xì)胞中miR-143-5p調(diào)控AGR2的機(jī)制還需挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。