趙 靜，張 祿，劉文博，裴曉芬，申國華

(山西省檢驗檢測中心，藥品檢驗技術(shù)研究所，太原 030031；*通訊作者,E-mail:sxczhfsgh@sina.com)

伴隨著經(jīng)濟(jì)、社會的不斷快速發(fā)展進(jìn)步，高血壓發(fā)病率呈低齡化、逐漸增加的趨勢，已成為我國乃至世界重要的公共衛(wèi)生問題[1]。降壓類化學(xué)藥品起效快，治療效果明顯，目前臨床應(yīng)用普遍，需長期服用，但同時具有很強(qiáng)的依賴性、停藥效應(yīng)以及對人體臟器的的損害等副作用[2]，這使得人們對低毒、損害小的中藥降壓制劑以及輔助降壓的保健食品受到追捧，不法廠商抓住人們的這一心理需求，并受巨大利益驅(qū)使，其在這類制劑中非法添加降壓類化學(xué)藥品，以夸大療效；但其添加的化學(xué)藥品的品種、劑量、純度、組合很隨意，根本不顧及給患者帶來的身心上傷害，且是長期服用，除造成耽誤患者的病情外，還使其身體受到很大的危害。因此，有必要制定相應(yīng)的檢測方法，為監(jiān)管部門打擊這種違法行為提供技術(shù)支持。

目前，雖然相關(guān)文獻(xiàn)已有不少相關(guān)檢測方法的刊載[3-5]，同時國家相關(guān)部門也已下發(fā)補(bǔ)充檢驗方法[6-7]，但是不法分子的添加方式、化學(xué)藥品的成分也在不斷更新，其故意回避上述文獻(xiàn)及補(bǔ)充檢驗方法中所涉及的化學(xué)藥品成分，以避免被監(jiān)管部門查處。本文所涉及到的組合非法添加的3個化學(xué)藥品成分為曲克蘆丁、美托拉宗、阿齊沙坦，其中曲克蘆丁為目前我國藥品標(biāo)準(zhǔn)中已收載的品種；美托拉宗屬于噻嗪類利尿劑，國內(nèi)還未上市，正處于申報階段；阿齊沙坦為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(沙坦類)的藥物，這些化學(xué)藥品臨床上多用于治療高血壓癥。本文采用液相色譜法定性并定量、液質(zhì)聯(lián)用定性確證的方法，針對中藥制劑及保健食品，以期達(dá)到可以同時檢測這3種非法添加化學(xué)藥品的目的。

1 儀器與試藥

Waterse2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Quintix224電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，DV215CD電子天平(美國奧豪斯),Thermo Q-Exactive高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(美國賽默飛)、ESI離子源；SHISEIDO C18色譜柱(日本資生堂)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Dikma Spursil C18(德國迪馬)(150 mm×2.1 mm,3 μm)柱；甲酸為色譜純，乙腈為色譜純(Dikma公司)，水為純化水，其余試劑均為分析純；曲克蘆丁(Troxerutin)，批號100416-201607，純度97.5%，購自中國食品藥品檢定研究院；美托拉宗(Metolazone)，批號21081338，純度99.5%，購自北京壇默質(zhì)檢科技股份有限公司；阿齊沙坦(Azilsartan)，批號13552，純度98.98%，購自QCS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心；所用供試品為舉報樣品(主要原料為：人參、決明子、葛根、蛹蟲草、梔子、菊花等)，批號為：LOT 425F0021，產(chǎn)地：江蘇省無錫市。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

2.1.1 液相定性及定量色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),柱溫30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；流速：1.0 ml/min；二極管陣列檢測器(DAD)，波長范圍190～400 nm；進(jìn)樣體積10 μl。梯度洗脫程序為：0～5 min，11%的乙腈；5.1～20 min,11%～60%的乙腈；20.1～25 min，60%～11%的乙腈。

2.1.2 液質(zhì)聯(lián)用定性色譜條件 C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)柱，柱溫30 ℃；流動相：同“2.1.1”；流速：0.2 ml/min；進(jìn)樣體積10 μl。梯度洗脫程序為：0～10 min,20%～90%的乙腈；10.1～11 min，90%～20%的乙腈。

2.1.3 液質(zhì)聯(lián)用定性質(zhì)譜條件 質(zhì)譜配有電噴霧離子源(ESI)，質(zhì)譜檢測參數(shù)：ESI+掃描，干燥氣溫度：320 ℃，鞘氣流速30 arb，輔助氣8 arb，噴霧電壓3.5 kV，碰撞能量20 cid；掃描方式：一級質(zhì)譜全掃描、二級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z50～800。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取上述曲克蘆丁、美托拉宗、阿齊沙坦3種對照品適量，用甲醇溶解，制成1.0 mg/ml的單標(biāo)對照品溶液，作為儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 固體制劑 取樣品適量，混勻，精密稱取相當(dāng)于一次口服劑量的供試品(蜜丸類可加入等量硅藻土進(jìn)行研磨處理；若未標(biāo)明一次口服劑量，建議取樣量范圍為1～2 g)，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 液體制劑 取樣品混勻，精密量取5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇15 ml，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)5 min，取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系

精密量取“2.2”項下儲備對照品溶液,用甲醇分別稀釋成從0.005 mg/ml至0.2 mg/ml范圍內(nèi)的梯度混合對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積面積為縱坐標(biāo)，計算所得回歸方程分別為：Y=13 998 639.14X-10 700.77，Y=50 796 992.87X+546.94，Y=28 128 592.29X+3 691.79，R2的值均大于0.999 8，可見3種成分在0.005～0.2 mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取線性中間濃度對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，3種化學(xué)成分峰面積的RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)值均小于0.9%，表明儀器精密度滿足要求。

2.6 定量限及檢出限

將“2.3”制備的供試品溶液逐級稀釋，過濾后進(jìn)樣，以峰高信噪比10 ∶1的對照品濃度為定量濃度，帶入稱樣量及定容體積后折算定量限，曲克蘆丁、美托拉宗、阿齊沙坦分別為22.4，18.3，21.6 μg/g；同法以峰高信噪比3 ∶1的對照品濃度為檢出濃度，折算檢出限，3種成分分別為10.1，7.5，8.6 μg/g。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”制備的供試品溶液，在制備完成后，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示3種成分的峰面積的RSD值均小于0.8%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取6份上述樣品，分別按“2.3”方法制備樣品溶液，計算含量結(jié)果，分別為3.6，1.3，6.8 mg/g，且對應(yīng)的RSD值均小于2.1%。

2.9 回收率試驗

采用加樣回收的方法，精密稱取上述已知3種成分含量的陽性樣品，減半取樣9份，分別計算添加80%，100%，120%加三水平的對照品，使制成的回收溶液濃度在線性范圍內(nèi)，按“2.3”項下樣品溶液制備方法制備，計算回收率,結(jié)果分別為98.3%，98.8%，99.1%，RSD均≤0.9%。

2.10 對照品及陽性樣品定性色譜及對應(yīng)紫外光譜結(jié)果

陽性樣品溶液中出現(xiàn)與“2.2”項下的3種對照品保留時間相同的色譜峰，且相應(yīng)的紫外光譜圖與上述3種對照品的光譜圖一致(見圖1A，B)。

2.11 專屬性試驗

取處方中人參、決明子、葛根、蛹蟲草、梔子、菊花等藥味，按《中國藥典》2020年版一部項下的【制法】規(guī)定，模擬制成陰性樣品，再依“2.3.1”項下制成陰性樣品供試品溶液，照“2.1”項下所述色譜方法進(jìn)行檢測，色譜結(jié)果表明，供試品溶液色譜中，在與曲克蘆丁、美托拉宗、阿齊沙坦3種對照品相同的保留時間處，無相應(yīng)的色譜峰，見圖1C。

1.曲克蘆??；2.美托拉宗；3.阿齊沙坦圖1 3種對照品、陽性樣品色譜及對應(yīng)紫外光譜圖及陰性樣品溶液色譜圖Figure 1 Chromatograms and their corresponding UV spectra of three reference substances and positive sample,and chromatogram of negative sample

2.12 液質(zhì)定性特征離子峰及質(zhì)譜圖

將“2.10”的陽性供試品溶液，用乙腈稀釋10倍以后，用質(zhì)譜進(jìn)行確證，結(jié)果表明，供試品中出現(xiàn)與曲克蘆丁、美托拉宗、阿齊沙坦3種對照品相一致的一級、二級質(zhì)譜圖，樣品的二級質(zhì)譜圖見圖2-4。

曲克蘆丁對照品及樣品[M+H+]m/z見圖2,一級質(zhì)譜母離子為743；二級質(zhì)譜分子離子碎片為435，597，581。

圖2 曲克蘆丁二級質(zhì)譜圖Figure 2 Troxerutin MS2 spectra

美托拉宗對照品及樣品[M+H+]m/z見圖3,一級質(zhì)譜母離子為366；二級質(zhì)譜分子離子碎片為259，277，211，178。

圖3 美托拉宗二級質(zhì)譜圖Figure 3 Metolazone MS2 spectra

阿齊沙坦對照品及樣品[M+H+]m/z見圖4,一級質(zhì)譜母離子為457；二級質(zhì)譜分子離子碎片為233，279，251，207，267，180。

圖4 阿齊沙坦二級質(zhì)譜圖Figure 4 Azilsartan MS2 spectra

3 討論

本文為降壓類中藥制劑及保健食品中非法添加化學(xué)藥品方法的研究[8，9]，可以作為此類制劑非法添加化學(xué)藥品的通用檢測方法，其不僅適用于中藥制劑及保健食品中非法添加降壓類化學(xué)藥品的準(zhǔn)確檢測，也適用上述類別制劑的快速定性篩查；由于中藥制劑中的成分比較復(fù)雜，添加化學(xué)藥品不容易很容易被忽視或漏檢，這就要求在日常檢驗工作中要有“研究型檢驗”的理念，不斷的研究創(chuàng)新，以適應(yīng)不斷變化的非法添加化學(xué)藥品檢測的需求；另外，本方法也能為藥品、食品及保健食品的監(jiān)管以及規(guī)范市場行為，提供技術(shù)支撐，對維護(hù)人民大眾的飲食用藥安全，具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。