陳 娜 邵 勤

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000）

番茄（Solanum lycopersium）為茄科茄屬一年生或多年生草本植物，在我國南北各地普遍種植，具有重要的經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價(jià)值［1］。番茄青枯病是由青枯菌引起的一種毀滅性的細(xì)菌性土傳病害，在我國南方地區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重，每年所造成的番茄減產(chǎn)可達(dá)50%～100%，已成為影響番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的重要病害之一［2-3］。因此，加大力度研究番茄對(duì)青枯菌脅迫的響應(yīng)機(jī)制，可為抗青枯病番茄品種的培育提供理論基礎(chǔ)。

植物在其生長發(fā)育過程中為了降低各種生物與非生物逆境對(duì)其的影響，會(huì)進(jìn)化出一套反應(yīng)機(jī)制來抵御外界脅迫，即通過轉(zhuǎn)錄因子與外界信號(hào)和基因調(diào)控相整合的方式產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白和代謝產(chǎn)物來適應(yīng)脅迫，從而提高植物的抗逆性［4］。NAC轉(zhuǎn)錄因子是近二十年來發(fā)現(xiàn)的植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其名稱由矮牽牛（Petunia hybrida）No Apical Meristem（NAM）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉(zhuǎn) 錄 激 活 因 子（ATAF1、ATAF2）和Cup-shaped cotyledon（CUC1/2）三個(gè)基因的首字母縮寫組成［5］。通常NAC蛋白在其N-端含有高度同源且能夠與DNA結(jié)合的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約150個(gè)氨基酸殘基組成，包含5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域（A、B、C、D、E），其C-端具有轉(zhuǎn)錄激活功能［6］。早期研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的生長發(fā)育［7］、次生壁形成［8］、激素信號(hào)傳導(dǎo)［9］、植株衰老［10］、果實(shí)成熟［11］以及各種非生物［12］和生物［13］脅迫響應(yīng)過程，并且隨著測序技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)掘與鑒定。如Li等［14］研究表明，葡萄（Vitis viniferaL.）VvNAC72通過抑制乙二醛酶ⅠVvGLYI-4的表達(dá)負(fù)向調(diào)控丙酮醛（methylglyoxal，MG）的解毒作用，并最終通過水楊酸介導(dǎo)的防御途徑調(diào)節(jié)MG-相關(guān)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)葡萄對(duì)霜霉病的抗性。目前有研究表明，番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子也參與了植物抗病性的響應(yīng)過程。Huang等［15］發(fā)現(xiàn)番茄SlNAC1在假單胞菌侵染過程中表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)。Liu等［16］報(bào)道番茄NAC基因SlSRN1是灰霉病菌（Botrytiscinerea）和丁香假單胞菌［Pseudomonas syringaepv.Tomato（PstDC3000）］防衛(wèi)響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子。Miao等［17］研究表明，番茄泛素連接酶SINA3（SEVEN IN ABSENTIA3）能夠泛素化一個(gè)防衛(wèi)相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC1，促進(jìn)其降解，并在防衛(wèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。黃瑩［18］在番茄中鑒定到4個(gè)能夠響應(yīng)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的NAC轉(zhuǎn)錄因子（SlNAC20、SlNAC24、SlNAC47和SlNAC61），并通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）試驗(yàn)得出，SlNAC61在響應(yīng)TYLCV侵染時(shí)起著正向調(diào)控作用。鄭晨飛［19］研究表明，番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC29在細(xì)菌性葉斑病抗性中具有重要的作用。Wang等［20］報(bào)道，過表達(dá)番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP1能夠顯著提高植株對(duì)葉斑病和青枯病的抗性。以上研究均表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的抗病性調(diào)控中扮演著重要角色。但目前關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控青枯病抗性的研究較少，其調(diào)控番茄青枯病的分子機(jī)理仍不清楚。

前期，宜春學(xué)院蔬菜遺傳育種與分子生物學(xué)課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序及表達(dá)譜分析，篩選到一個(gè)表達(dá)差異顯著的NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2。本研究以SlNAP2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以番茄高抗青枯病和高感青枯病株系為材料，分析該轉(zhuǎn)錄因子的序列結(jié)構(gòu)以及在不同外源激素和青枯菌脅迫下的表達(dá)模式，通過VIGS技術(shù)進(jìn)一步對(duì)其參與番茄抗青枯病過程進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)深入研究NAC轉(zhuǎn)錄因子在番茄與青枯病互作中的作用機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為兩個(gè)番茄自交系株系，高抗青枯病材料Hm 2-2（R），高感青枯病材料BY 1-2（S），由浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育得到。

番茄青枯菌病原、VIGS載體pTRV1和pTRV2菌株均由江西省作物生長和發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，載體圖譜如圖1。

圖1 pTRV1和pTRV2載體圖譜Fig.1 The map of pTRV1 and pTRV2 vectors

pMD19-T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101均購自廣州圍谷潤儀器有限公司。

1.2 番茄SlNAP2基因的克隆

利用HiPure Total RNA Mini Kit RNA提取試劑盒（Magen，廣州）提取番茄高抗青枯病材料Hm 2-2的總RNA；以HiScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，南京）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，以該cDNA為模板擴(kuò)增SlNAP2基因序列。運(yùn)用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物（表1），引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。PCR體系共20μL：10 mmol·L-1正反向引物各1μL，100～200 ng·μL-1模板cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix（Vazyme，南京）10 μL，滅菌ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并用Genstar膠回收試劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，最后將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，用通用引物pMD19-F/R進(jìn)行檢測，挑取陽性克隆菌落搖菌，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果確定基因的最終序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 番茄SlNAP2基因的生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果正確的SlNAP2基因序列通過NCBI在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定該基因的最大開放閱讀框（open reading frame，ORF），同時(shí)將該基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；運(yùn)用NCBI在線程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）對(duì)該基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；運(yùn)用Clustalw2在線工具（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進(jìn)行同源性比對(duì)；運(yùn)用MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建；運(yùn)用ProtParam在線程序（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測SlNAP2的蛋白理化性質(zhì)；適用Expasy-ProtScale在線程序（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測SlNAP2的親疏水性；二級(jí)結(jié)構(gòu)通過SOPMA在線程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測；三級(jí)結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL在線程序（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測；使用TMHMM Server v.2.0在線程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)番茄SlNAP2基因編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.4 番茄SlNAP2基因表達(dá)特性分析

SlNAP2組織特異性基因表達(dá)分析：在番茄長至五葉時(shí)，分別取番茄抗感青枯病材料Hm 2-2和BY 1-2的根、莖、葉片等不同組織進(jìn)行液氮速凍，于-80℃條件下保存，用于后續(xù)總RNA提取。

SlNAP2在不同處理下的基因表達(dá)分析：待番茄抗感青枯病材料Hm 2-2和BY 1-2長至五葉時(shí)接種青枯菌病原（1×108CFU·mL-1），同時(shí)進(jìn)行0.2 mmol·L-1水楊酸（salicylic acid，SA）和1.5 mmol·L-1茉 莉 酸 甲 酯（methyl jasmonate，MeJA）激素噴施處理，以清水噴施為對(duì)照。接種青枯菌和噴施激素處理后0、3、6、9 h取樣。所有樣品進(jìn)行液氮速凍，于-80℃條件下保存，用于后續(xù)總RNA提取。

利用HiPure Total RNA Mini Kit RNA提取試劑盒（Magen，廣州）進(jìn)行總RNA提?。灰訦iScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，南京）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以番茄Actin（Solyc03g078400）作為內(nèi)參基因，以StepOne Real-Time PCR儀（Applied Biosystems，Thermo Fisher，美國）進(jìn)行qRT-PCR，檢測SlNAP2基因在不同組織及不同處理中的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×RealStar Green Fast Mixture（with ROX）10μL，上下游引物qSlNAP2F/R（10 mmol·L-1）各0.4μL，cDNA 0.5μL，無RNase水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SlNAP2基因相對(duì)表達(dá)量［21］。

1.5 利用VIGS技術(shù)分析番茄SlNAP2基因功能

在已獲得的SlNAP2基因cDNA序列中，選取ORF非保守區(qū)的約120 bp片段，設(shè)計(jì)引物VSlNAP2-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序同1.2。將VIGS載體pTRV2質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物分別用EcoRI和SmaI進(jìn)行酶切37℃2 h，酶切后將所得產(chǎn)物進(jìn)行酶失活70℃15 min，然后用T4連接酶［寶生物工程（大連）有限公司］將載體和PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接體系10 μL：pTRV2載體2 μL，PCR回收產(chǎn)物5 μL，350 U·μL-1T4 DNA Ligase 0.5 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，ddH2O 0.5 μL、16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞DH5α，構(gòu)建TRV∷SlNAP2重組載體。將pTRV2空載體（TRV∷Empty）及重組載體（TRV∷SlNAP2）分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞GV3101，將pTRV-1菌株分別與TRV∷SlNAP2及TRV∷Empty菌株1∶1（V/V）進(jìn)行混合，注射至番茄抗病材料Hm2-2的葉片中，注射清水為對(duì)照CK。2 d后采用斷根灌根法接種青枯菌，5～7 d后觀察對(duì)照植株與沉默植株的表型，拍照和采樣，具體步驟參照陳娜［22］的方法。提取總RNA，通過qRT-PCR測定目的基因SlNAP2的表達(dá)量，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlNAP2基因的cDNA序列克隆

以番茄抗青枯病Hm2-2為試驗(yàn)材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增SlNAP2序列，得到1 200 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2-A）。切膠回收，將純化后的片段連接至pMD19-T載體上（圖2-B），挑取陽性克隆搖菌，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果得出SlNAP2的全長為1 227 bp，大小與圖2-A相符。

圖2 番茄SlNAP2基因Fig.2 Tomato SlNAP2 gene

2.2 番茄SlNAP2基因的序列分析

進(jìn)一步分析番茄SlNAP2基因序列，其ORF為828 bp（圖3），起于175位，止于1 003位，共編碼了275個(gè)氨基酸。在SlNAP2的N-端存在1個(gè)典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域（11～135 aa）（圖4）。

圖3 SlNAP2 cDNA及預(yù)測的開放閱讀框Fig.3 Sequences of SlNAP2 cDNA and predicted ORF

圖4 SlNAP2的保守區(qū)Fig.4 Conservative domain of SlNAP2

2.3 番茄SlNAP2基因編碼的蛋白同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過番茄SlNAP2編碼的蛋白與其他物種的同源蛋白序列比對(duì)可知，番茄SlNAP2編碼的蛋白與其他物種的蛋白相似度較高，并且SlNAP2與其他NAC轉(zhuǎn)錄因子一樣，N-端的氨基酸序列保守性很強(qiáng)，可進(jìn)一步劃分為A、B、C、D、E 5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域，C-端高度特異（圖5）。運(yùn)用MEGA6.0軟件對(duì)番茄和其他10種植物的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，并制作進(jìn)化樹，結(jié)果表明，番茄SlNAP2基因編碼的蛋白與潘那利番茄SpNAP2基因編碼的蛋白同源性最高，其次為馬鈴薯，與毛果楊、橡膠樹等植物的蛋白同源性較低（圖6）。

圖5 番茄SlNAP2蛋白與其他物種同源蛋白多重序列比對(duì)Fig.5 Multiple alignment of homologous protein for the SlNAP2 in tomato and other species

圖6 SlNAP2同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of SlNAP2 homologous protein

2.4 番茄SlNAP2基因編碼的蛋白的生物信息學(xué)分析

番茄SlNAP2蛋白的理化性質(zhì)用ProtParam在線程序進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。SlNAP2蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為31 877.23 Da，理論等電點(diǎn)pI為8.56，總負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為31，總正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為34，其蛋白的分子式為C1423H2187N383O421S15，脂肪系數(shù)為62.69，不穩(wěn)定指數(shù)為24.52，是一種穩(wěn)定蛋白。平均親水指數(shù)為-0.730，同時(shí)運(yùn)用Expasy-ProtScale在線程序分析得出SlNAP2表現(xiàn)出親水性（圖7）。綜上，該蛋白為堿性穩(wěn)定親水性蛋白。

表2 SlNAP2蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physical and chemical parameters of SlNAP2 protein

圖7 SlNAP2蛋白親疏水性分析Fig.7 Hydrophilic analysis of SlNAP2 protein

2.5 番茄SlNAP2基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜性預(yù)測

通過SOPMA在線程序?qū)lNAP2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，得出α-螺旋（alpha helix）比例為21.82%，延伸鏈結(jié)構(gòu)（extended strand）的比例為13.09%，β-折疊（beta turn）的比例為3.27%，無規(guī)則卷曲（random coil）比例為61.82%（圖8-A）。以上結(jié)果表明該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲所構(gòu)成，延伸鏈結(jié)構(gòu)和β-折疊所占的比例較低。

為進(jìn)一步了解番茄SlNAP2蛋白的結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL對(duì)番茄SlNAP2蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的建模分析，結(jié)果如圖8-B所示。SlNAP2蛋白的主要結(jié)構(gòu)是螺旋和無規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果一致。

圖8 SlNAP2編碼的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Secondary and tertiary structure prediction of protein encoded by SlNAP2 gene

使用TMHMM Server v.2.0在線程序?qū)Ψ裇lNAP2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖9）。

圖9 SlNAP2基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.9 Transmembrane structure analysis of protein encoded by SlNAP2 gene

2.6 SlNAP2基因表達(dá)分析

2.6.1SlNAP2基因的組織特異性分析對(duì)SlNAP2在番茄不同組織中的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，在番茄抗病材料（R）和感病材料（S）中，SlNAP2均在莖中的表達(dá)量最高，葉中次之，根中最低，并且SlNAP2在抗病材料（R）中的表達(dá)量高于在感病材料（S）中的表達(dá)量（圖10-A）。表明SlNAP2在番茄中的表達(dá)具有組織特異性。

2.6.2SlNAP2基因?qū)Ψ亚嗫莶∶{迫及SA和MeJA處理的響應(yīng)在番茄五葉時(shí)接種青枯菌，于不同時(shí)間點(diǎn)收集葉片樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測分析，結(jié)果如圖10-B顯示。接種青枯菌后，SlNAP2基因表達(dá)量不斷增加，表明青枯菌能夠誘導(dǎo)SlNAP2基因的表達(dá)，并且與番茄青枯菌侵染程度呈正相關(guān)。分別以0.2 mmol·L-1SA和1.5 mmol·L-1MeJA處理番茄植株，檢測SlNAP2對(duì)外源激素的響應(yīng)，結(jié)果顯示，SA處理后，SlNAP2基因的表達(dá)量呈先降后升的趨勢（圖10-C）；MeJA處理后，SlNAP2基因的表達(dá)量呈下降的趨勢（圖10-D）。推測SlNAP2可能通過SA、MeJA通路參與番茄對(duì)青枯菌的脅迫響應(yīng)。

圖10 番茄SlNAP2基因表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of tomato SlNAP2 gene

2.7 SlNAP2基因?qū)Ψ亚嗫莶〉目剐哉{(diào)控

分別提取接種CK、TRV∷Empty和TRV∷SlNAP2后7 d的番茄葉片RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示，與接種清水和空載體TRV∷Empty的植株相比，在TRV介導(dǎo)SlNAP2沉默的抗病植株中，SlNAP2基因表達(dá)量顯著低于CK和TRV∷Empty植株（圖11-A），表明TRV∷SlNAP2接種抗病植株后能有效沉默SlNAP2基因。對(duì)番茄植株的葉片進(jìn)行表型觀察，接種清水和TRV∷Empty植株的葉片沒有明顯的變化，而接種TRV∷SlNAP2的植株葉片表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀（圖11-B），表明沉默SlNAP2基因降低了番茄植株對(duì)青枯病的抗性。

圖11 SlNAP2基因?qū)Ψ亚嗫莶〉目剐哉{(diào)控分析Fig.11 Analysis of SlNAP2 gene regulation of tomato resistance to bacterial wilt

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，也是植物中數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅廣泛參與植物生長發(fā)育的調(diào)控過程，而且在逆境脅迫響應(yīng)過程中扮演著重要的角色，因此研究NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。近年來，隨著全球基因組測序工作的展開，很多物種的全基因組測序已經(jīng)完成。到目前為止，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)NAC基因家族包含188個(gè)基因［23］，蘋果為180個(gè)基因［24］，水稻為151個(gè)基因［25］，擬南芥為117個(gè)基因［26］，毛果楊為120個(gè)基因［27］，番茄為104個(gè)基因［28］，葡萄為74個(gè)基因［29］。本研究鑒定了番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果表明，SlNAP2蛋白和其他NAC蛋白一樣，其N-端含有NAM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的，進(jìn)一步可分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，與大部分前人研究結(jié)果一致［30-31］。通過對(duì)SlNAP2編碼的蛋白分析結(jié)果可知，該蛋白為親水蛋白，與榮玉萍等［32］研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，該蛋白以無規(guī)則卷曲為主，與譚秦亮等［33］對(duì)菠蘿NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果基本一致。

前人研究證實(shí)植物抵抗生物脅迫的防衛(wèi)響應(yīng)與外源激素信號(hào)分子有密切的聯(lián)系，如植物激素MeJA和SA是重要的植物抗性分子，在調(diào)節(jié)植物對(duì)生物脅迫的反應(yīng)中扮演著重要角色［34］，而NAC轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)植物應(yīng)激響應(yīng)的關(guān)鍵因子和植物病原菌防衛(wèi)響應(yīng)的重要因子而得到廣泛關(guān)注。有研究證實(shí)，NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠通過植物激素參與植株的生物脅迫響應(yīng)過程，如水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子ONAC122和ONAC131在稻瘟菌（Magnaporthe grisea）侵染后誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)ONAC122和ONAC131能夠被外源激素SA和MeJA所誘導(dǎo)，沉默該基因提高了植株對(duì)稻瘟菌的易感性，研究結(jié)果表明ONAC122和ONAC131在水稻抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［35］。Chen等［36］研究表明，茄子SmNAC通過抑制ICS1（SA合成基因）的表達(dá)來抑制SA的積累，從而降低植株對(duì)青枯病的抗性。馬鈴薯StNACb4能夠被青枯菌、SA和MeJA所誘導(dǎo)，沉默NbNACb4基因可增強(qiáng)煙草對(duì)青枯菌的敏感性，相反過表達(dá)StNACb4基因則增強(qiáng)了煙草對(duì)青枯菌的耐受性，表明StNACb4在馬鈴薯抗青枯病脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用［37］。本研究通過探究青枯菌和SA、MeJA激素脅迫下SlNAP2在番茄抗感材料中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)η嗫菥?、茉莉酸甲酯和水楊酸脅迫處理均有不同程度的響應(yīng)，表明SlNAP2確實(shí)參與響應(yīng)青枯菌生物脅迫和激素脅迫。其中SA誘導(dǎo)的SlNAP2的表達(dá)趨勢與青枯菌誘導(dǎo)的變化趨勢相似，推測SlNAP2可能通過SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與番茄對(duì)青枯菌的脅迫響應(yīng)。

前人研究證實(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了番茄生物脅迫的響應(yīng)過程，如在煙草中過表達(dá)番茄SlNAC35能夠增強(qiáng)植株對(duì)細(xì)菌性病原菌的抗性［38］；番茄轉(zhuǎn)錄因子NAC29在細(xì)菌性葉斑病抗性中具有重要作用［19］；番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC089是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的免疫（endoplasmic reticulum stress-mediated immunity，ERSI）和植物對(duì)病原體抗性所必需的［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，在番茄中利用VIGS技術(shù)沉默SlNAP2之后接種青枯菌病原，番茄抗病材料的葉片表現(xiàn)出萎蔫癥狀，說明SlNAP2在番茄對(duì)青枯病的抗性中發(fā)揮著正調(diào)控作用。本研究結(jié)果證實(shí)了NAC轉(zhuǎn)錄因子在番茄生物脅迫響應(yīng)過程中的作用，但其調(diào)控番茄青枯病的分子機(jī)理仍未清楚，今后可進(jìn)一步進(jìn)行SlNAP2與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的互作分析，并可開展SlNAP2與青枯菌病原無毒或致病基因相關(guān)蛋白互作研究，從而明確番茄SlNAP2轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控青枯病，對(duì)SlNAP2的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入的分析。這對(duì)培育持久、廣譜抗性的番茄品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

本研究從番茄中克隆得到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAP2，全長1 227 bp，編碼275個(gè)氨基酸，為堿性穩(wěn)定親水性蛋白，且與潘那利番茄SpNAP2親緣關(guān)系最近。qRT-PCR分析結(jié)果表明，SlNAP2基因的表達(dá)具有組織特異性，同時(shí)番茄SlNAP2基因可受到青枯菌、水楊酸和茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)。進(jìn)一步利用VIGS技術(shù)沉默SlNAP2后接種青枯菌，番茄植株對(duì)青枯病的抗性降低，表明SlNAP2在番茄抗青枯病過程中起正調(diào)控作用。