丁延慶 徐建霞 汪 燦 周棱波 張國兵 趙 強(qiáng) 邵明波 張立異

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所，貴州貴陽 550006）

高粱（Sorghum bicolorL.Moench）是世界第五大糧食作物，在食品、飼料、纖維、釀造和生物能源原料等方面被廣泛應(yīng)用。在我國，高粱主要種植在西南、華北和東北地區(qū)，每年有超過80%的高粱籽粒作為白酒釀造原料［1-3］。高粱籽粒釀造性狀包括總淀粉含量、支鏈淀粉含量、單寧含量、硬度和顏色等。淀粉是產(chǎn)生酒精的主要物質(zhì)，籽?？偟矸酆颗c出酒率成正比，而支/直鏈淀粉含量與糊化率相關(guān)，影響釀造工藝。籽粒硬度由角質(zhì)（玻璃質(zhì)）率決定，而角質(zhì)率與蛋白質(zhì)含量呈正比，對(duì)白酒品質(zhì)有較大影響。單寧又稱原花青素，在白酒釀造過程中不僅具有抑制有害微生物作用，而且能產(chǎn)生丁香酸、丁香醛、香草醛、阿魏酸等化合物，從而賦予白酒獨(dú)特的香味［4］。此外，籽粒顏色受單寧含量影響，也是酒用高粱育種的一個(gè)重要指標(biāo)［5］。

高粱籽粒釀造性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀。結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）等分子標(biāo)記，利用遺傳群體開展高粱數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）定位是研究數(shù)量性狀的重要方法［6］。目前，位于10號(hào)染色體上編碼顆粒結(jié)合淀粉合成酶的Wax基因已被克?。?］。Murray等［8］利用85個(gè)AFLP和68個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)176個(gè)家系的重組自交系（recombinant inbred lines，RIL）群體（BTx623×Rio）開展基因分型，在1、3和4號(hào)染色體上確定了4個(gè)與籽?？偟矸酆坑嘘P(guān)的QTL?；?15個(gè)RFLP和85個(gè)AFLP標(biāo)記的基因分型，前人構(gòu)建了包含125個(gè)家系的F5群體（RTx430×Sureno）和379個(gè)家系（IS2807×249）的RIL的遺傳圖譜，并在2、3和7號(hào)染色體上定位了4個(gè)影響籽粒硬度的QTL［9-10］。在籽粒顏色和單寧含量方面，目前科研人員已經(jīng)克隆了位于1號(hào)染色體上影響籽粒顏色的Y基因［11］，以及分別位于4號(hào)和2號(hào)染色體上控制籽粒單寧含量的Tan1和Tan2基因［12-13］。利用118個(gè)SSR和8個(gè)Indel標(biāo)記，白春明等［14］構(gòu)建了包含325個(gè)家系RIL群體（BTx623×Rio）的遺傳圖譜，在1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)和6號(hào)染色體上檢測(cè)到3個(gè)與單寧含量和6個(gè)與籽粒顏色相關(guān)的QTL位點(diǎn)。

隨著高粱基因組測(cè)序的完成，基于高通量測(cè)序的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（genotyping by sequencing，GBS）越來越多地應(yīng)用于高粱QTL定位。GBS是在二代測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基于酶切試驗(yàn)對(duì)特定區(qū)域進(jìn)行測(cè)序從而降低基因組復(fù)雜度的方法，具有快速、簡(jiǎn)便、低成本發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)［15］。通過GBS技術(shù)，Habyarimana等［16］利 用S.bicolor×S.halepense構(gòu) 建 的RIL，準(zhǔn)確定位了控制高粱籽粒中多酚、單寧和類黃酮含量的QTL。Sukumaran等［17］對(duì)包含248個(gè)家系的RIL群體（Tx436×MN7645），使用GBS進(jìn)行基因分型獲得了7 144個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)，準(zhǔn)確定位了與高粱產(chǎn)量、開花時(shí)間和持綠性狀相關(guān)的QTL。同樣利用該技術(shù)，Kong等［18］對(duì)來源于BTx623×IS3620C的399個(gè)RILs構(gòu)建了包含616個(gè)Bin標(biāo)記的高粱遺傳圖譜，檢測(cè)到36個(gè)調(diào)控株型和開花性狀的QTL［18］。Super-GBS是基于GBS進(jìn)一步發(fā)展的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，在SNP標(biāo)記的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、分型準(zhǔn)確性等特點(diǎn)上優(yōu)于GBS，已應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位以及全基因組關(guān)聯(lián)分析等研究［19-21］。但目前利用Super-GBS技術(shù)在高粱中開展遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位的研究仍鮮見報(bào)道。

鑒于此，本研究通過美國品種BTx623與貴州茅臺(tái)酒專用品種紅纓子雜交構(gòu)建包含205個(gè)家系的RIL群體，利用Supper-GBS技術(shù)開展全基因組基因分型，以期確定影響籽?？偟矸酆?、支鏈淀粉含量、單寧含量、硬度和顏色的QTL，并對(duì)重要遺傳區(qū)段內(nèi)的基因進(jìn)行注釋，確定影響重要QTL的候選基因，旨在為關(guān)鍵基因的進(jìn)一步克隆和酒用高粱遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究利用貴州省旱糧研究所收集的美國高粱籽粒品種BTx623為母本，貴州酒用高粱品種紅纓子為父本配置雜交組合，得到F1植株后，采用單粒傳法在貴州貴陽和海南三亞兩地進(jìn)行輪流加代，構(gòu)建了包含205個(gè)家系的RIL群體。BTx623是非糯高粱，總淀粉含量較高，籽粒較硬，顏色為白色，不含單寧；紅纓子是糯高粱，籽粒較軟，顏色為紅色，單寧含量較高。

1.2 表型調(diào)查

2020—2021年連續(xù)兩年分別在貴州貴陽、貴州安順和海南三亞進(jìn)行RIL群體及雙親材料種植。小區(qū)長(zhǎng)2 m，行距60 cm，株距20 cm，人工點(diǎn)播，適時(shí)進(jìn)行常規(guī)大田管理工作。在抽穗期，每個(gè)株系中選擇5個(gè)高粱穗用硫酸鈉紙袋套袋自交，在整穗完成授粉時(shí)，將紙袋換成網(wǎng)袋，直至種子成熟。收獲后進(jìn)行曬干脫粒，選擇飽滿無損傷的籽粒200 g，利用XDS谷物品質(zhì)分析儀（美國福斯公司）進(jìn)行籽?？偟矸酆浚╰otal starch content，TSC）、支鏈淀粉含量（amylopectin content，AC）和單寧含量（tannin content，TC）的測(cè)定：（1）采用改進(jìn)最小二乘法（modified PLS）回歸技術(shù)，通過不同散射處理和導(dǎo)數(shù)處理建立預(yù)測(cè)模型；（2）將100份不同類型高粱資源的化學(xué)測(cè)定值作為驗(yàn)證集，對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證和非參數(shù)檢驗(yàn)，從而獲得最優(yōu)預(yù)測(cè)模型；（3）測(cè)定時(shí)將樣品放入分析盤的樣品杯中，在波長(zhǎng)400～2 489 nm范圍內(nèi)進(jìn)行3次光譜掃描，每個(gè)性狀以3株的平均值為最終的表型值。使用GWJ-2谷物硬度計(jì)（杭州金科利達(dá)公司）測(cè)定高粱籽粒硬度（grain hardness，GH），每個(gè)株系隨機(jī)選取30粒種子進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)3次，取平均值作為表型數(shù)據(jù)。籽粒顏色（grain color，GC）參照《高粱種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［22］進(jìn)行分級(jí)賦值，1～5級(jí)依次對(duì)應(yīng)白色、灰色、黃色、黃褐色和紅褐色。

1.3 基因分型

在2020年貴州貴陽環(huán)境，采集四葉期RIL家系的新鮮嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）方法提取DNA，將質(zhì)檢合格的DNA樣品送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行Super-GBS文庫的構(gòu)建，并通過Illumina Nova PE150平臺(tái)測(cè)序。以高粱品種BTx623的基因組序列作為參考（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Sbicolor_v3_1_1），使 用bwa和GATK軟 件進(jìn) 行SNP篩 選，利用vcftools軟件對(duì)獲得的SNP分型結(jié)果進(jìn)行過濾，過濾條件為：缺失率小于20%，次等位基因頻率大于5%的二等位位點(diǎn)。利用親本的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)，其中BTx623基因組為參考基因組，紅纓子已完成基于深度重測(cè)序的全基因組測(cè)序［23］。完成親本間標(biāo)記開發(fā)后，對(duì)RIL群體的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記位點(diǎn)篩選，只保留親本基因型為純合且有差異的標(biāo)記，共獲得16 474個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。

1.4 遺傳圖譜構(gòu)建與QTL分析

使用JoinMap 5.0軟件對(duì)RIL群體的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記過濾和遺傳圖譜構(gòu)建，過濾條件為：（1）刪除卡方檢驗(yàn)顯著性P<0.05的位點(diǎn)；（2）刪除RIL群體中基因型缺失值>5%的個(gè)體；（3）相似度等于1的位點(diǎn)只保留1個(gè)。采用Kosambi函數(shù)構(gòu)建遺傳圖譜，根據(jù)5個(gè)籽粒性狀的表型數(shù)據(jù)，使用QTL IciMapping 4.2軟件的完備區(qū)間作圖法（inclusive composite interval mapping，ICIM）進(jìn)行QTL鑒定，染色體步移長(zhǎng)度設(shè)定為0.1 cM，逐步回歸概率為P<0.001，篩選似然率（likelihood of odds，LOD）大于2.5的QTL位點(diǎn)，最后計(jì)算每個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，QTL參照蘇代群等［24］的方法進(jìn)行命名。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)各個(gè)環(huán)境的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、頻率分布等描述性統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析。在Sorghum QTL（http：//aussorgm.org.au/sorghumqtl-atlas/）網(wǎng)站查找已被報(bào)道的QTL信息，從Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）網(wǎng)站上獲得高粱品種BTx623的參考基因組信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體的性狀表型變異與相關(guān)性分析

在貴州貴陽（2020—2021年）、貴州安順（2021年）和海南三亞（2020年）的4個(gè)環(huán)境下開展親本和RIL群體的表型數(shù)據(jù)調(diào)查。結(jié)果表明，除籽粒顏色外，RIL群體的總淀粉含量、支鏈淀粉含量、單寧含量和籽粒硬度均表現(xiàn)為連續(xù)變異，表型平均值在2個(gè)親本表型值范圍內(nèi)，變異系數(shù)為1.72%～64.97%。RIL群體各性狀的偏度和峰度絕對(duì)值均小于1，說明各性狀指標(biāo)均呈正態(tài)分布（表1），是受多基因控制且易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，適合進(jìn)行QTL定位。為了解不同環(huán)境下各性狀之間的關(guān)系，進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。籽粒顏色與單寧含量在4個(gè)環(huán)境下均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），R值平均為0.55，變異范圍為0.53～0.56；支鏈淀粉含量與總淀粉含量在所有環(huán)境下均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），R值平均為0.28，變異范圍為0.23～0.33。

表1 4個(gè)環(huán)境下親本及RIL群體籽粒釀造相關(guān)性狀的表型統(tǒng)計(jì)Table 1 Phenotypic statistics of grain brewing related traits in parents and RIL population in four environments

表2 高粱籽粒釀造相關(guān)性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of grain brewing related traits in sorghum

2.2 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用Super-GBS技術(shù)對(duì)205個(gè)家系的RIL群體進(jìn)行全基因組基因分型，共獲得16 474個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記。采用Kosambi函數(shù)構(gòu)建了覆蓋了高粱10條染色體的遺傳連鎖圖譜。除去冗余SNP后，最終圖譜的標(biāo)記數(shù)為1 910個(gè)，圖譜長(zhǎng)度為905.10 cM，標(biāo)記間平均距離為0.47 cM（表3）。不同染色體的圖譜距離和標(biāo)記密度變化范圍較大，其中遺傳圖距最長(zhǎng)和標(biāo)記密度最高的是2號(hào)染色體，其遺傳長(zhǎng)度和標(biāo)記間平均距離分別為128.45和0.38 cM；圖距最短的是5號(hào)染色體（61.48 cM）和10號(hào)染色體（61.94 cM）；密度最低的是7號(hào)染色體，其標(biāo)記間平均距離為0.72 cM。

表3 RIL群體中10條染色體遺傳圖距長(zhǎng)度及SNP標(biāo)記密度Table 3 Genetics distance length and SNP marker density of 10 chromosomes in the RIL population

2.3 籽粒釀造相關(guān)性狀QTL定位

利用ICIM方法，在4個(gè)環(huán)境下共定位到35個(gè)QTL與籽粒的5個(gè)釀造性狀相關(guān)，分別位于1～9號(hào)染色體上（表4、圖1）。與總淀粉含量、支鏈淀粉含量、單寧含量、籽粒硬度和籽粒顏色相關(guān)的QTL分別有9、7、11、5和3個(gè)，一共涉及到28個(gè)染色體區(qū)段。

表4 4個(gè)環(huán)境下高粱籽粒釀造相關(guān)性狀的QTL定位Table 4 QTL mapping of sorghum grain brewing related traits in in four environments

影響總淀粉含量的9個(gè)QTL分別位于1號(hào)（2個(gè)）、3號(hào)（1個(gè)）、4號(hào)（1個(gè)）、5號(hào)（2個(gè)）、6號(hào)（1個(gè)）和9號(hào)（2個(gè)）染色體上。在3個(gè)環(huán)境下均能檢測(cè)到位于4號(hào)染色體的qTSC4.1，其最大LOD值和表型貢獻(xiàn)率分別為9.93和20.33%。在2020年貴陽環(huán)境下檢測(cè)到2個(gè)QTL（qTSC1.1和qTSC9.2），LOD值變化范圍為3.12～3.23，可解釋的表型變異率為6.39%～6.45%。除qTSC1.1、qTSC1.2、qTSC3.1和qTSC4.1外，其他5個(gè)QTL的增效等位基因均來源于親本BTx623。

影響支鏈淀粉含量的7個(gè)QTL分別位于3（2個(gè)）、4（3個(gè)）、7（1個(gè)）和9（1個(gè)）號(hào)染色體上。在2個(gè)環(huán)境下都定位到1個(gè)位于4號(hào)染色體上的重要QTL（qAC4.1），其最大LOD值和表型貢獻(xiàn)率分別為4.45和9.22%。5個(gè)QTL（qAC3.1、qAC3.2、qAC4.1、qAC4.2、qAC4.3）的增效等位基因來源于親本紅纓子，其他2個(gè)QTL（qAC7.1和qAC9.1）的增效等位基因來源于親本BTx623。

與單寧含量相關(guān)的11個(gè)QTL分別位于1號(hào)（1個(gè)）、2號(hào)（3個(gè)）、3號(hào)（2個(gè)）、4號(hào)（2個(gè)）、6號(hào)（1個(gè)）和9號(hào)（2個(gè)）染色體上。2個(gè)重要的QTL在4個(gè)環(huán)境中均能夠被檢測(cè)到，位于4號(hào)的qTC4.1的平均LOD值為27.57，變化范圍為23.34～32.13，可解釋平均表型貢獻(xiàn)率為36.51%，變化范圍為33.11%～40.53%。位于6號(hào)染色體的qTC6.1的平均LOD值為13.62，變化范圍為10.61～18.85，可解釋平均表型貢獻(xiàn)率為14.49%，變化范圍為11.67%～18.51%。在3個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到2個(gè)QTL（qTC1.1和qTC4.2），最大LOD值分別為4.36和6.46，表型貢獻(xiàn)率分別為4.19%和6.77%。除qTC9.1和TC9.2以外，其他9個(gè)QTL增效的等位基因均來源于親本紅纓子。

影響籽粒硬度的5個(gè)QTL分別位于3號(hào)（2個(gè)）、7號(hào)（1個(gè)）、8號(hào)（1個(gè)）和9號(hào)（1個(gè)）染色體上。其中，位于3號(hào)和9號(hào)染色體上的2個(gè)重要QTL（qGH3.2和qGH9.1）能夠在2個(gè)環(huán)境下被檢測(cè)到，最大的LOD值分別為6.00和4.21，表型貢獻(xiàn)率分別為12.53%和8.22%。在5個(gè)QTL中，除了qGH9.1以外，其他4個(gè)QTL的增效等位基因均來源于親本BTx623。

與籽粒顏色相關(guān)的3個(gè)QTL分別定位于1號(hào)（1個(gè)）、4號(hào)（1個(gè)）和6號(hào)（1個(gè)）染色體上。在4個(gè)環(huán)境下均檢測(cè)到的2個(gè)重要QTL（qGC1.1和qGC4.1）定位于1號(hào)和4號(hào)染色體上，LOD值分別為8.82～15.59和19.74～31.25，表型貢獻(xiàn)率范圍為9.85%～17.07%和28.40%～44.96%。在3個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到的qTC6.1位于6號(hào)染色體，其LOD值和表型貢獻(xiàn)率分別為2.53～4.67和2.73%～5.52%。上述3個(gè)QTL的增效等位基因均來源于親本紅纓子。

綜合比較，與5個(gè)性狀相關(guān)的QTL涉及到28個(gè)遺傳區(qū)段，其中3個(gè)重要區(qū)段在多個(gè)性狀中被同時(shí)定位（圖1）。與總淀粉含量、單寧含量和籽粒顏色相關(guān)的QTL在1號(hào)染色體的66.30～71.55 Mb區(qū)段上重疊，與總淀粉含量、支鏈淀粉含量、單寧含量和籽粒顏色相關(guān)的QTL在4號(hào)染色體的54.00～62.3 Mb區(qū)段上重疊，與單寧含量和籽粒顏色相關(guān)的QTL在6號(hào)染色體的54.59～57.57 Mb區(qū)段上重疊。

圖1 高粱籽粒釀造相關(guān)性狀QTL在遺傳圖譜上的分布Fig.1 Distribution of QTLs for sorghum grain brewing related traits on genetic map

2.4 候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)上述QTL定位結(jié)果，對(duì)1號(hào)染色體（66.30～71.55 Mb）、4號(hào)染色體（54.00～62.3 Mb）以及6號(hào)染色體（54.59～57.57Mb）的三個(gè)重要區(qū)段進(jìn)行了候選基因分析，利用植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/），識(shí)別QTL區(qū)間內(nèi)高粱相關(guān)基因ID、蛋白質(zhì)注釋信息及相應(yīng)的其他物種（水稻和擬南芥）的同源基因，結(jié)合前人研究文獻(xiàn)［11，13，26，34-35］，確定了8個(gè)候選基因（表5）。除已經(jīng)被克隆的Y基因和Tan1基因以外，本研究還注釋到了6個(gè)新的候選基因，包括與類黃酮合成途徑相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Sobic.006G175700以及編碼黃烷酮3-羥化酶的基因Sobic.006G253900。其他4個(gè)基因則與植物淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)，包括編碼β-淀粉酶的基因Sobic.001G372100，是催化植物淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖的重要基因，以及編碼淀粉合酶Ⅱ的Sobic.004G238600基因，是淀粉合成途徑的4種關(guān)鍵基因之一。

表5 QTL區(qū)間候選基因功能注釋Table 5 Functional annotation of candidate genes in QTL mapping

3 討論

自元朝（公元前749-652年）以來，我國高粱一直就是釀造著名白酒的重要原料［25］，如貴州茅臺(tái)、瀘州老窖、五糧液、汾酒等都是利用高粱作為主要的釀酒原料。因此，開展釀造相關(guān)性狀的遺傳學(xué)研究，發(fā)展緊密連鎖的分子標(biāo)記，利用標(biāo)記輔助育種技術(shù)加快酒用高粱新品種選育具有重要意義。

籽粒顏色是選育高粱單寧含量的指標(biāo)，即隨著籽粒顏色的加深，單寧含量增加［14］。但是本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，單寧含量和籽粒顏色之間呈正相關(guān)關(guān)系，Pearson系數(shù)約等于0.5。這說明籽粒顏色并不是高粱單寧含量的可靠指標(biāo)，在酒用高粱新品種選育中，僅根據(jù)籽粒顏色的深淺來判斷單寧含量的可能會(huì)導(dǎo)致較大的偏差。

目前，在水稻和玉米中涉及淀粉合成途徑的相關(guān)基因研究較為透徹［26］，而在高粱中，雖然對(duì)籽?？偟矸酆俊⒅保ㄖВ╂湹矸酆恳约芭呷橄炠|(zhì)/角質(zhì)性狀進(jìn)行了一些QTL定位［6］，但是目前僅有Wax基因被克隆［7］。本研究中，影響支鏈淀粉含量的2個(gè)QTL（qAC3.2和qAC9.1）與前人的研究結(jié)果接近［27］，而總淀粉含量的4個(gè)QTL（qTSC1.2、qTSC3.1、qTSC4.1和qTSC9.1）則與已報(bào)道的QTL區(qū)間重疊［28］。通過同源基因比對(duì)，在qTSC1.2和qTSC4.1的區(qū)間上發(fā)現(xiàn)了4個(gè)候選基因，與其他作物中已報(bào)道的淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因同源［26］，推測(cè)是參與高粱籽粒淀粉合成的候選基因。然而，由于本試驗(yàn)所構(gòu)建的遺傳圖譜在10號(hào)染色體頂端存在一個(gè)缺口（Gap），導(dǎo)致Wax基因所在染色體區(qū)域缺少SNP標(biāo)記，因此，在本研究中Wax基因未能被檢測(cè)到。

在糧食作物籽粒硬度的遺傳基礎(chǔ)研究方面，控制小麥籽粒硬度的基因Pina和Pinb已經(jīng)被克?。?9］。但關(guān)于高粱籽粒硬度的QTL定位報(bào)道仍較少［9-10，30］，目前已定位的8個(gè)QTL位于2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和10號(hào)染色體上，其中位于3號(hào)和7號(hào)染色體的QTL與本研究發(fā)現(xiàn)的qGH3.2和qGH7.1定位區(qū)間一致。推測(cè)本研究中發(fā)現(xiàn)的其他3個(gè)遺傳位點(diǎn)可能是新的QTL，但尚未找到與小麥等其他作物籽粒硬度相關(guān)的同源基因，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

單寧和花青素由類黃酮途徑的一個(gè)特定分支產(chǎn)生，涉及數(shù)十個(gè)結(jié)構(gòu)基因和多個(gè)調(diào)控基因，這些基因已在水稻［31］和玉米［32］和擬南芥［33］中得到較為全面的研究。迄今為止，在高粱中只克隆了2個(gè)調(diào)控單寧合成的基因，分別是編碼WD40蛋白的Tan1（Sobic.004G280800）基因［13］和編碼bHLH結(jié)構(gòu)域蛋白的Tan2（Sobic.002G0 76600）基因［12］。在本研究中，位于4號(hào)染色體的qTC4.1和qGC4.1與Tan1基因位點(diǎn)重疊。而位于2號(hào)染色體的Tan2基因則沒有被檢測(cè)到，其原因是2個(gè)親本BTx623和紅纓子在這個(gè)基因上沒有多態(tài)性，而基因測(cè)序結(jié)果也證實(shí)這兩個(gè)親本的Tan2基因序列完全相同（結(jié)果未報(bào)道）。而與單寧含量相關(guān)的另外3個(gè)QTL（qTC1.1、qTC3.2和qTC9.1）也與前人定位結(jié)果重疊［25］。本研究確定的控制籽粒顏色的qGC1.1位于1號(hào)染色體66.30～71.55 Mb區(qū)間，與控制高粱籽粒顏色的Y1基因位點(diǎn)一致［11］。同時(shí)，在4個(gè)環(huán)境中還檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與單寧含量和籽粒顏色相關(guān)的8個(gè)QTL均位于6號(hào)染色體上的同一區(qū)段（54.59～57.26 Mb），目前在高粱研究中還未見報(bào)道。通過同源基因比對(duì)，在其附近確定了2個(gè)重要的候選基因：一個(gè)候選基因?yàn)镾obic.006G175700，與水稻Kala4基因同源，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子，通過激活類黃酮合成相關(guān)基因產(chǎn)生特異色素，導(dǎo)致水稻籽粒變黑［34］；另一個(gè)候選基因?yàn)镾obic.006G253900，是擬南芥中黃烷酮3-羥化酶（F3H）同源物［35］，屬于類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)也證實(shí)了高粱品種Tx430中轉(zhuǎn)入F3H基因后植株中類黃酮化合物含量較野生型顯著上升［36］。

此外，本研究還確定了幾個(gè)潛在的控制高粱單寧和淀粉生物合成的候選基因。為了進(jìn)一步精確鑒定等位變異位點(diǎn)，后續(xù)將利用基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的集群分離法（bulked segregation analysis，BSA），加密作圖群體的目標(biāo)區(qū)段；隨后，將對(duì)候選基因進(jìn)行序列分析和表達(dá)分析，以確定基因多態(tài)性，為單寧和淀粉遺傳變異在作物改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用Super-GBS技術(shù)，構(gòu)建了包含205個(gè)RILs（Bx623×紅纓子）的SNP高密度遺傳連鎖圖譜。在四個(gè)環(huán)境下共定位到9個(gè)總淀粉含量、7個(gè)支鏈淀粉含量、11個(gè)單寧含量、5個(gè)籽粒硬度和3個(gè)籽粒顏色相關(guān)的QTLs。在多個(gè)環(huán)境和性狀中確定了3個(gè)重要遺傳區(qū)段，分別位于1號(hào)、4號(hào)和6號(hào)染色體，包含了已經(jīng)克隆的Y1和Tan1基因位點(diǎn)，同時(shí)篩選出6個(gè)與籽粒淀粉含量、支鏈淀粉含量、單寧含量以及顏色相關(guān)的候選基因。