肖明婧，楊逢清，閆芳

（山西農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801）

由于濫用抗生素，導致大量耐藥細菌，特別是多重耐藥致病菌的出現(xiàn)，并廣泛傳播，不僅給人類健康造成重大威脅，也導致家畜致病和致死率的上升[1]。目前，已開發(fā)出多種飼料中添加的抗生素替代物，主要包括生物酶制劑、益生菌、合生素和中藥提取物等，其中益生菌在養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)展勢頭迅猛，應用廣泛，并已取得良好的效果[2]。

乳酸菌因其可產生抵抗外界病原微生物入侵的相關代謝產物而備受關注，這些物質可抑制致病微生物的生長、定植和感染宿主消化道，并可維持宿主消化道的健康和菌群平衡[3]。機體免疫細胞在乳酸菌菌體和其代謝產物的刺激下，產生了可增強機體免疫應答的一系列物質[4]。王蕾等[5]研究表明，采用乳酸菌灌胃后，動物的飼料轉化率提高，免疫力增強，生產性能得到很大提升。

邊雞是一種適宜在晉北地區(qū)飼養(yǎng)的地方品種，具有較強的抗病力和適應性，在耐粗飼方面表現(xiàn)優(yōu)良，因其蛋肉兩用性受到消費者歡迎，被列入農業(yè)農村部《畜禽遺傳資源保護名錄》[6]。本研究分離了邊雞腸道中3株優(yōu)勢乳酸菌，通過比較添加混合乳酸菌與添加抗生素對雛雞體質量、免疫力、抗氧化能力和抗體水平等指標的影響，旨在進一步探究將乳酸菌作為飼料添加劑替代抗生素的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1日齡雞雛100只（山西康牧養(yǎng)殖專業(yè)合作社）。G（唾液乳桿菌，GenBank登錄號：MN448316）、Y（植物乳桿菌，GenBank登錄號：MT645503）和F（嗜酸乳桿菌，GenBank登錄號：MT645504）3株乳酸菌菌株均分離自邊雞小腸。乳酸菌細菌培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司，血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）和抗氧化試劑盒購自太原安尼摩爾生物科技有限公司，雞新城疫（NDV）疫苗La Sota株購自武漢塞維爾生物科技有限公司、新城疫抗原和陽性血清購自北京擎科生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合菌液制備 分別于MRS液體培養(yǎng)基中接種G、Y、F等3種菌株，37 ℃下?lián)u菌24～48 h，培養(yǎng)至活菌數(shù)達1.0×1010cfu/mL后，用生理鹽水稀釋至活菌數(shù)分別為1.0×109、1.0×108cfu/mL。將3株不同濃度乳酸菌按照體積比為1∶1∶1混合，配制成3種濃度的混合菌液。

1.2.2 試驗動物的分組、飼養(yǎng)管理和免疫接種 根據(jù)《飼料添加劑安全使用規(guī)范》[7]和《微生物飼料添加劑通用要求》[8]設計試驗。選取體質量相近的1日齡雛雞100只，隨機分成對照組、抗生素添加組（50 mg/kg金霉素）和高劑量（1.0×1010cfu/mL）、中劑量（1.0×109cfu/mL）、低劑量（1.0×108cfu/mL）混合乳酸菌組，每組20只。預飼期1～7 d，飼喂相同日糧，試驗期8～42 d，混合乳酸菌組每日灌服不同濃度的乳酸菌1 mL/只，對照組和抗生素組灌服等量生理鹽水。人工飼喂，自由采食飲水，溫度為25 ℃，相對濕度為50%～60%，定期通風。在第7天和第25天，采用常規(guī)免疫方法（滴鼻點眼）給所有雞雛接種NDV疫苗。

1.2.3 免疫指標測定 試驗第6、24、42天，每組選取6只雛雞采血，離心后將血清用于血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）以測定NDV抗體效價。預飼期第7天空腹稱質量，42 d采血，分離血清后冷凍保存，用于抗氧化指標和血清免疫球蛋白含量的測定。采血后屠宰，分離胸腺、脾臟和法氏囊后稱質量，計算免疫器官指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

分別采用Excel 2016和SPSS 21.0對雛雞體質量、免疫器官指數(shù)、血清免疫球蛋白含量、血清抗氧化指標、新城疫抗體（NDV）效價進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。

2 結果與分析

2.1 添加混合乳酸菌對雛雞體質量的影響

7、42 d時各組雛雞體質量比較如表1所示。

表1 7、42 d時各組雛雞體質量比較Tab.1 The comparison of body weight of chicks in different groups at 7 days and 42 days g

由表1可知，7 d時各試驗組與對照組體質量無 顯著差異（P＞0.05），42 d時各試驗組與對照組雛雞體質量差異顯著（P＜0.05），中劑量組的體質量與抗生素組無顯著差異（P＞0.05）。說明在灌服混合乳酸菌后雛雞體質量增長較快，促生長效果顯著（P＜0.05）。

2.2 混合乳酸菌對雛雞免疫器官指數(shù)的影響

由圖1可知，脾臟、胸腺、法氏囊等免疫器官指數(shù)在服用混合乳酸菌后，試驗組與對照組差異顯著（P＜0.05）；雖然中劑量組在數(shù)值上高于抗生素組，但差異不顯著（P＞0.05）。說明各免疫器官在灌服受試物后生長發(fā)育速度較快，灌服該受試物后可提高雛雞抵抗外界應激的能力。

圖1 各組雛雞免疫指數(shù)比較Fig.1 The comparison of immunity indexes of chicks in different groups

2.3 混合乳酸菌對雛雞血清免疫球蛋白的影響

各組雛雞血清免疫球蛋白含量比較結果如圖2所示。

圖2 各組雛雞血清免疫球蛋白含量比較Fig.2 The comparison of serum immunoglobulin content of chicks in different groups

由圖2可知，服用混合乳酸菌后各劑量組和抗生素組與對照組血清中IgA含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組和抗生素組IgA含量無顯著差異（P＞0.05）。各劑量組和抗生素組與對照組血清中IgG含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組與抗生素組和高劑量組之間無顯著差異（P＞0.05），且抗生素組與高劑量組之間也無顯著差異（P＞0.05）。各劑量組和抗生素組與對照組血清IgM含量差異顯著（P＜0.05），IgM含量中劑量組高于抗生素組，但差異不顯著（P＞0.05）。以上結果說明混合乳酸菌液可提高雛雞血清中的免疫球蛋白含量，增強雛雞免疫力。

2.4 混合乳酸菌對雛雞血清抗氧化指標的影響

從圖3可以看出，高劑量組和抗生素組與對照組的MDA含量差異顯著（P＜0.05），而對照組和低劑量組無顯著性差異（P＞0.05），中、高劑量組和抗生素組的MDA含量差異不顯著（P＞0.05）。各劑量組與對照組的T-AOC含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組與抗生素組無顯著性差異（P＞0.05）。高劑量組和抗生素組與對照組的SOD含量差異顯著（P＜0.05），中劑量組和抗生素組之間差異不顯著（P＞0.05）。各劑量組與對照組的GSHPx含量均存在顯著差異（P＜0.05），中劑量組高于抗生素組，但差異不顯著（P＞0.05）。上述研究結果表明，混合乳酸菌可有效提高血清中抗氧化物含量，提高機體抗氧化能力。

圖3 各組雛雞血清抗氧化指標比較Fig.3 The comparison of serum antioxidant indexes of chicks in different groups

2.5 混合乳酸菌對雛雞新城疫抗體效價的影響

由表2可知，試驗組雛雞NDV母源抗體第6天時轉為陰性。相比第6天，各組NDV抗體效價第24天時顯著上升，且試驗組與對照組之間差異顯著（P＜0.05），中劑量組和抗生素組間無顯著差異（P＞0.05）；在第2次免疫后，42 d時，各組NDV抗體效價均顯著高于對照組（P＜0.05），中劑量組和抗生素組無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組雛雞新城疫抗體（NDV）效價比較Tab.2 Titer comparison of newcastle disease antibody（NDV） of chicks in different groups

3 結論與討論

3.1 添加混合乳酸菌對雛雞體質量的影響

體質量變化可直觀地反映益生菌對動物機體的影響。益生菌的促生長作用已得到廣泛證實，益生菌可通過調節(jié)腸道菌群平衡提高動物的消化吸收能力并起到促生長作用[9]。黃騰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用植物乳桿菌飼喂蛋雞后增質量效果明顯，與本研究結果一致。表明添加抗生素和乳酸菌均可提高動物體質量，促進動物生長，且乳酸菌在一定程度上可替代抗生素在飼料中添加。

3.2 添加混合乳酸菌后對雛雞免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽中樞免疫、外周免疫和體液免疫的主要器官，上述器官的發(fā)育情況直接反映了機體的免疫水平，免疫器官相對質量的提高則反映了機體免疫系統(tǒng)的成熟和免疫功能的增強[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加不同劑量的混合乳酸菌可刺激雛雞免疫器官的生長發(fā)育，各組免疫器官指數(shù)與抗生素組無顯著差異，但高劑量組并未表現(xiàn)出更好的效果，這與袁林等[13]的研究結果一致，說明給雛雞飼喂一定劑量的混合乳酸菌可促進其免疫器官的生長發(fā)育。

3.3 添加混合乳酸菌對雛雞血清免疫球蛋白水平的影響

血清免疫球蛋白在機體免疫活動過程中發(fā)揮著重要作用，免疫球蛋白是一類機體應對外界病原入侵過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質分子，血清中此類物質的含量與機體抵抗外界病原入侵的能力有關[14]。IgG在病原微生物入侵機體的早期發(fā)揮了重要作用；IgM是分子量較大的免疫球蛋白，在病原微生物入侵早期發(fā)揮作用，但作用時間較短；IgA則主要在黏膜免疫中發(fā)揮作用，通過非特異性免疫協(xié)同作用清除機體內的有害微生物[14]。本研究中，添加混合乳酸菌后，血清中的免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）含量相比對照組顯著提高，與袁文華[15]、賀馭[16]、邵洪偉[17]、周凌博等[18]的研究結果一致。中劑量組（1.0×109cfu/mL）與抗生素組的免疫球蛋白水平無顯著差異，可以在一定程度上替代抗生素的使用。

3.4 添加混合乳酸菌對雛雞抗氧化功能的影響

動物機體內氧化和抗氧化系統(tǒng)之間存在動態(tài)平衡關系，當動物患病或應激時，產生的過量自由基若無法及時清除會導致機體的損傷[19]，破壞正常細胞功能[20]。GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA在機體抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用，是衡量機體氧化和抗氧化能力的重要指標[20]。本研究結果顯示，添加混合乳酸菌能顯著提升機體中GSH-Px、SOD、T-AOC的含量并降低MDA的含量，且中劑量組（1.0×109cfu/mL）與抗生素組無顯著差異。李樂[21]和劉硯涵等[22]研究也表明，采用乳酸菌飼喂蛋雞可增強機體清除自由基的能力，加快蛋雞的生長速度，并可替代抗生素在飼料中使用。

3.5 添加混合乳酸菌對新城疫抗體效價的影響

在家禽生產中，使用疫苗防控禽類流行性疾病的發(fā)生已成為主要手段[20]。沈玉林等[23]研究發(fā)現(xiàn)，疫苗的免疫效果受外界因素影響較大，飼料中霉菌和真菌產生的有害物質帶來的疫苗效價抑制問題已成為養(yǎng)殖過程中一個不可忽視的因素。王興勇等[24]研究發(fā)現(xiàn)，疫苗的效價與采用的生物安全防治措施有關，通過添加具有免疫增強效果的物質可提高機體的免疫力，目前已成為養(yǎng)殖和獸藥生產部門研發(fā)過程中的重點。本研究表明，NDV抗體水平在飼喂混合乳酸菌液后明顯提高，24 d時對雛雞進行抗體水平檢測可見抗體水平上升，二次免疫后，抗體水平仍較高，說明在上述免疫方案下，將乳酸菌結合NDV疫苗使用，可顯著增強免疫效果。中劑量組（1.0×109cfu/mL）與抗生素組抗體水平無顯著差異（P＞0.05），但高劑量組并未體現(xiàn)出免疫增強作用，表明試驗結果受混合乳酸菌濃度的影響。

灌服乳酸菌混合液對雛雞的體質量和免疫器官的發(fā)育具有促進作用，并提高了免疫力和機體清除氧化自由基的能力以及NDV抗體效價水平。本研究建議在飼料中添加混合乳酸菌的最佳濃度為1.0×109cfu/mL，在此濃度下與抗生素具有相近效果。