張良舜，葉樺

胃癌的發(fā)病率一直居高不下，其發(fā)病機制涉及眾多基因和分子信號通路。生物信息分析結(jié)合分子生物學(xué)與信息技術(shù)，能夠高效、大規(guī)模的獲取生物信息。本文對公共基因芯片數(shù)據(jù)庫（GEO)中的胃癌表達(dá)譜芯片進行信息技術(shù)分析，從而獲得差異表達(dá)基因，研究差異表達(dá)基因所參與的信號通路和相互作用機制，有助于對胃癌病理機制的深入了解，協(xié)助尋找防治胃癌的有效方法，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術(shù)信息中心GEO中胃癌數(shù)據(jù)集，編號分別為GSE118897和GSE79973，均為Expression profiling by array，種屬均為Homosapiens，包括20例胃癌組織和20例正常胃組織。

1.2 數(shù)據(jù) 處理及差異基因篩選GEO中的原始數(shù)據(jù)集采用Affy、FunRich、Limma、Pheatmap及Ggplot2R等程序包在R軟件中進行分析，使用RMA算法進行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化及表達(dá)值計算。處理后數(shù)據(jù)采用Fold-change（FC）和T-test進行差異基因篩選，標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05且｜log（FC）｜＞1。

1.3 基因本體論（GO）富集分析 和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析使用R軟件中的cluster Profiler程序包對差異表達(dá)基因分別進行GO富集分析和KEGG信號通路分析。通過GO對基因?qū)傩赃M行注釋[1]，從而了解差異表達(dá)基因的功能、定位及參與的生物學(xué)途徑。采用Blast2Go軟件，從生物過程（BP）、分子功能（MF）以及細(xì)胞組分（CC）三個方面對差異表達(dá)基因進行注釋。生物體內(nèi)生理病理變化是一系列基因協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，KEGG通路數(shù)據(jù)庫收錄了生物學(xué)過程、疾病發(fā)生機理等多個方面的通路信息[2]。通過計算機利用基因信息對復(fù)雜的細(xì)胞活動和生物體行為作出計算推測。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將兩組樣本篩選出的差異表達(dá)基因采用String 11.5分析，對胃癌差異表達(dá)基因進行蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置最低要求互動分?jǐn)?shù)大于0.7。利用Cytoscape軟件（version 3.9.0）計算評分，取最高相關(guān)度的前幾名作為關(guān)鍵基因。采用MCODE插件對網(wǎng)絡(luò)模型進行評價，選擇score＞3，node＞4模塊中的基因進行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié) 果獲得229個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因96個（41.9%），下調(diào)基因133個（58.1%），見封二彩圖1a。兩組胃癌芯片數(shù)據(jù)集的差異基因表達(dá)熱圖見封二彩圖1b。

圖1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因GO富集分析 對共同上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)基因進行GO富集分析，以氣泡圖的形式呈現(xiàn)，見封二彩圖2。尤其關(guān)注BP和MF的結(jié)果，其中糖胺聚糖結(jié)合、膠原結(jié)合、整合素結(jié)合、趨化因子活性、酶抑制劑活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合和磷脂酶抑制劑活性最為顯著。

圖2 差異表達(dá)基因GO富集分析

2.3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析 差異表達(dá)基因主要涉及礦物質(zhì)吸收、胰腺分泌物、瘧疾、細(xì)胞周期及細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用等通路，見封二彩圖3。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

2.4 差異表達(dá)基因PPI分析 基于String數(shù)據(jù)庫，篩選出最高度連通性的6個節(jié)點基因作為關(guān)鍵基因，分別是周期蛋白依賴性激酶（CDK1）、細(xì)胞分裂周期20同源物（CDC20）、細(xì)胞分裂周期關(guān)聯(lián)8（CDCA8）、驅(qū)動蛋白家族成員2C（KIF2C）、母系胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）、泛素結(jié)合酶E2C（UBE2C）。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵模塊分析 在Cytoscape軟件中，使用MCODE插件對PPI進行關(guān)鍵模塊的篩選，篩選出2個重要的子模塊。A模塊MCODE得分為19.4，由21個節(jié)點和194個相互作用關(guān)系構(gòu)成（封二彩圖4a），均為上調(diào)基因，由紅色表示；B模塊MCODE得分為5.0分，由5個節(jié)點和10個相互作用關(guān)系構(gòu)成（封二彩圖4b），均為下調(diào)基因，由綠色表示。對PPI中2個重要子模塊所包含差異表達(dá)基因進行GO富集分析和KEGG信號通路分析。模塊A中GO富集分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在后期促進復(fù)合物結(jié)合、ATP結(jié)合和激酶結(jié)合等分子功能中發(fā)揮重要作用，參與后期促進復(fù)合物依賴性分解代謝過程、有絲分裂紡錘體微管與動粒的附著和細(xì)胞周期檢查點等生物過程。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等信號通路有密切關(guān)聯(lián)。模塊B中KEGG信號通路分析結(jié)果顯示礦物質(zhì)吸收過程中發(fā)揮作用。

圖4 MCODE分析差異表達(dá)基因的關(guān)鍵子模塊

3 討論

胃癌的發(fā)病機制是個多基因多通路的復(fù)雜進展過程[3-4]。雖然手術(shù)切除仍然是治療胃癌的主要方式，但通過對胃癌發(fā)生機制相關(guān)基因及信號通路的深入探索，有助于開發(fā)新的胃癌治療靶點，對提高預(yù)后有積極作用。

本研究基于String數(shù)據(jù)庫型篩選出CDK1、CDC20、CDCA8、KIF2C、MELK和UBE2C 6個得分較高的關(guān)鍵基因，對上述6個核心基因進一步文獻(xiàn)挖掘。發(fā)現(xiàn)胰島素基因增強子結(jié)合蛋白1在絲氨酸269位點上被CDK1磷酸化，增強了其與周期蛋白B1和周期蛋白B2啟動子的結(jié)合，增強了其在胃癌中的轉(zhuǎn)錄活性[5]。CDC20表達(dá)在多種人類癌癥中增加，并在腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。Ding等[6]數(shù)據(jù)表明CDC20上調(diào)與胃癌的侵襲性進展和預(yù)后不良有關(guān)。驅(qū)動蛋白家族成員-23和CDCA8的表達(dá)存在正相關(guān)，驅(qū)動蛋白家族成員-23可能通過影響CDCA8的表達(dá)來促進胰腺癌的增殖[7]。本文中發(fā)現(xiàn)CDCA8在胃癌中上調(diào)，但是否能夠促進胃癌的增殖需要實驗進一步證明。KIF2C是驅(qū)動蛋白家族成員之一，是一種微管運動蛋白，其過表達(dá)與胃癌和結(jié)腸直腸癌患者的淋巴浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。MELK是一種細(xì)胞周期依賴性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可能是針對胃癌治療的潛在目標(biāo)[9]。MELK是一種原癌基因，參與多種通路調(diào)節(jié)，可以通過FAK/Paxillin途徑促進胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。UBE2C屬于E2泛素偶聯(lián)酶家族成員，能夠調(diào)控有絲分裂檢驗點以及控制細(xì)胞周期進程。UBE2C在許多人類惡性腫瘤中具有致突性的致癌作用，在胃癌患者中經(jīng)常過度表達(dá)，UBE2CmRNA代替基因組擴增的高表達(dá)是在胃腺癌中觀察到的主要變化[10]。上述的6個核心基因也均涉及細(xì)胞周期的過程，目前已知的Ki-67已經(jīng)廣泛使用在消化道早期腫瘤ESD術(shù)后標(biāo)本的免疫組化實驗，這種蛋白存在于細(xì)胞核中，蛋白的數(shù)量和細(xì)胞的分裂周期有非常緊密的聯(lián)系。筆者經(jīng)常使用Ki-67來協(xié)助早癌消化道腫瘤的診斷，在臨床上具有重要意義。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等信號通路有密切關(guān)聯(lián)。GO富集分析的生物過程結(jié)果中，比如有絲分裂紡錘體微管與動粒的附著過程和后期促進復(fù)合物依賴性分解代謝過程，都涉及細(xì)胞周期。

綜上所述，本文通過生物信息學(xué)方法分析胃癌組織和正常胃組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多個關(guān)鍵基因和通路都涉及細(xì)胞周期。有序進行的細(xì)胞周期是維持生命體正常代謝和活動的前提。細(xì)胞周期相關(guān)基因和通路能夠調(diào)控細(xì)胞周期進而控制細(xì)胞增殖，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[11-12]。通過干預(yù)細(xì)胞周期相關(guān)基因和細(xì)胞信號通路來抑制胃癌發(fā)生和進展是當(dāng)下研究熱點。本研究結(jié)果為胃癌的發(fā)病機制、治療和預(yù)后判斷等研究提供了重要依據(jù)，需要結(jié)合進一步實驗驗證。