王亞麗,賈旭旭

(寧夏師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 固原 756000)

手性R-2，3-二氯-1-丙醇(R-2，3-dichloro-1-Propanol 或R-2，3-DCP)是重要的藥物中間體.常被用于合成二氯丙酮、乙酸纖維、水處理劑等多種化工產(chǎn)品，還可用于合成抗病毒藥物“更昔洛韋”(用于治療艾滋病、器官移植病毒感染等)[1-3]，也是合成離子交換樹脂、環(huán)氧氯丙烷(ECH)和環(huán)氧樹脂等物質(zhì)的中間體.但是由于R-2，3-二氯-1-丙醇合成過程受催化劑選擇性的限制，目前報道的合成方法中其產(chǎn)率并不高.而催化劑氯過氧化物酶(CPO)由于其特殊的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)，具有對底物手性識別的功能，能進(jìn)行一些特殊的手性催化，選擇性很高，近年來引起了藥學(xué)界和商業(yè)界的廣泛關(guān)注.目前的研究結(jié)果表明其被用作催化小分子烯烴環(huán)氧化、小分子炔烴羥基化以及有機(jī)硫化物磺化氧化等[4-6]方面催化效果顯著.

目前甘油合成二氯丙醇都是在羧酸等化學(xué)催化劑作用下實現(xiàn)的，在酸性反應(yīng)環(huán)境中，甘油和羧酸首先進(jìn)行酯化反應(yīng)，生成羧酸甘油酯[7-8].然后，氯離子與羧酸甘油酯生成3-氯-1，2-丙二醇和2-氯-1，3-丙二醇，繼續(xù)反應(yīng)則可生成2，3-二氯-1-丙醇和1，3-二氯-2-丙醇，但是該生產(chǎn)方法得到的都是外消旋體，還需通過拆分才能得到R-2，3-二氯-1-丙醇，而拆分后產(chǎn)率并不好.怎樣直接合成手性的二氯丙醇仍是一個需要解決的問題，而且目前已知的合成方法產(chǎn)率都不高[9].基于此本文嘗試以氯過氧化物酶作催化劑，利用其對底物的手性識別功能，催化氧化甘油氯化一步反應(yīng)制備R-2，3-DCP.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

氯過氧化物酶(Rz= 1.05，Sigma-Aldrich公司)，甘油(國藥試劑)，叔丁基過氧化氫(國藥試劑)，30% 過氧化氫(國藥試劑)，四甲基溴化銨(阿拉丁試劑)，四乙基溴化銨(阿拉丁試劑)，四丙基溴化(銨阿拉丁試劑)，四丁基溴化銨(阿拉丁試劑)，無水乙醇(國藥試劑)，無水亞硫酸鈉(國藥試劑)，磷酸二氫鉀(國藥試劑)，磷酸氫二鉀(國藥試劑)，乙酸乙酯(國藥試劑).

主要儀器為GC2014氣相色譜儀(日本島津)，UV-1700 型紫外分光光度計(日本島津)，Chirascan圓二色光譜儀(英國應(yīng)用光物理公司)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀HP6890/5973N(美國安捷倫)，WZZ-2B自動旋光儀(上海精科)，超導(dǎo)傅立葉數(shù)字化核磁共振譜儀(Bruker)，YS-10A型元素型超純水儀(上海摩科).

1.2 實驗方法

1.2.1 CPO 酶催化TBHP/H2O2氧化甘油的反應(yīng)

在50 mL的燒瓶中加入15 mL一定pH的0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS)，加入0.001 mol甘油和0.05 mol的NaCl溶液攪拌30 min后，加入0.20 μmol CPO攪拌10 min，再加入0.002 mol過氧化氫(H2O2)，其中H2O2采取分次加入的方式，每隔10 min加一次.在25 ℃及固定轉(zhuǎn)速下避光攪拌反應(yīng)一定時間后，加入無水Na2SO3停止反應(yīng).用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相后采用無水Na2SO4干燥，干燥后的產(chǎn)物用于氣相色譜分析表征，計算產(chǎn)率及選擇性.

1.2.2 產(chǎn)物氣相色譜分析

色譜柱參數(shù)為β-DEX 120手性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、FID 檢測器、載氣(氮氣、氫氣流速保持在55 mL·min-1、柱頭壓為0.06 MPa、進(jìn)樣體積為0.3 μL.采用程序升溫，初始溫度50 ℃，以15 ℃·min-1升溫到110 ℃后保持5 min，再以25℃·min-1升到160 ℃后保持2 min).采用與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行對照來定性分析；采用標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線對產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，計算產(chǎn)率和光學(xué)純度(ee值).

1.2.3 產(chǎn)物表征及分析

(i)產(chǎn)物旋光性的測定

將數(shù)顯旋光儀的光學(xué)系統(tǒng)以傾斜20°安裝在基座上，溫度設(shè)置為25℃，光源采用20瓦鈉光燈，選擇合適長度的旋光管盛裝溶液，準(zhǔn)備測量.首先調(diào)零，然后測定旋光度，得到實驗數(shù)據(jù)為16.5°，確定溶液具有旋光性，而且數(shù)顯為正，確定其為右旋物質(zhì)，則產(chǎn)物趨于R型.同時也可讀出物質(zhì)的比旋光度，確定物質(zhì)的純度，實驗中發(fā)現(xiàn)溶液的濃度以及旋光管的長度對旋光度均有影響.

(ii)產(chǎn)物核磁共振圖譜測試實驗通過對CPO酶促鹵化甘油反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)提純分離后，溶解于氘代試劑中進(jìn)行核磁分析，結(jié)果如圖1和圖2所示.

化學(xué)位移 (1×10-6)

從圖1(1H NMR)可以看出，在以氘代氯仿作溶劑時，300 Hz的核磁圖譜中，除去零點峰外，中間有5個明顯的峰位，為5個不同的氫原子峰，每個峰位數(shù)值均不同，第一個化學(xué)位移為4.18的氫為手性碳上的氫，緊接著化學(xué)位移為4.07和3.95的氫，它們是與氯原子相連的首位碳上的氫，而化學(xué)位移為3.82和3.83是與羥基相連的碳上的兩個氫，羥基氫原子由于受多種因素的影響，化學(xué)位移范圍一般為2～5，綜合分析可以確定化學(xué)位移1.81處為羥基氫的峰位.通過對1H核磁譜圖進(jìn)行積分，以判斷此物質(zhì)為 2，3-二氯-1-丙醇.

化學(xué)位移 (1×10-6)

圖2為核磁13C圖譜，有三個明顯的碳原子峰,根據(jù)化學(xué)位移依次為63.45的碳原子峰，為與羥基相連的碳，61.32的碳原子峰為中間與氯相連的碳，也就是手性碳，44.03的碳原子峰，為左邊與氯相連的碳.其實驗測定值與理論值(63.33，61.09，44.38)基本相符，進(jìn)一步證明所合成的產(chǎn)物是2，3-二氯-1-丙醇.

為了更進(jìn)一步對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，實驗還進(jìn)行了GC-MS表征，通過氣相色譜讓混合物中的組分分離，用質(zhì)譜鑒定分離出來的組分并確定其含量.與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照，確定同樣出峰位置在2.367 min得到離子流強(qiáng)度最高的峰.此峰經(jīng)過質(zhì)譜鑒定得到質(zhì)荷比(m/z)為62和31兩種明顯的碎片峰，其中m/z=62的質(zhì)譜峰豐度最高，參考譜庫確定該豐度為2，3- DCP質(zhì)譜圖，最終確定保留時間在2.367 min的色譜峰確實是2，3- DCP.測試結(jié)果進(jìn)一步定性說明生成物為2，3- DCP.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化劑的選擇

在酶作催化劑的反應(yīng)中，最常用的氧化劑為叔丁基過氧化氫和過氧化氫，但在以過氧化物酶家族為催化劑的部分反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)使用H2O2作催化劑會降低酶的活性，因此一些反應(yīng)采取叔丁基過氧化氫(TBHP)代替H2O2作氧化劑.本實驗同時開展兩組實驗分別以H2O2和TBHP作為氧化劑，CPO作催化劑催化合成手性二氯丙醇.其他反應(yīng)條件均相同，反應(yīng)中分別加入相同量的兩種氧化劑，反應(yīng)結(jié)束后計算產(chǎn)率，分別為46.2%和41.8%，ee%值分別為91.4%和91.3%，可見該反應(yīng)以H2O2作氧化劑時產(chǎn)率較高，而ee值影響不大.從綠色化學(xué)的角度考慮，H2O2在該反應(yīng)中除了具有良好的氧化性能，還具有對環(huán)境友好性能，所以采用其作催化劑.

確定氧化劑H2O2后，考察其用量對反應(yīng)收率的影響，確定當(dāng)?shù)孜锔视团cH2O2的物質(zhì)的量比為1∶2時，R-2，3-二氯-1-丙醇的收率達(dá)到最高44.5 %，其ee值為90.8%.當(dāng)增加氧化劑用量時，R-2，3-二氯-1-丙醇的收率反而降低，這是因為隨著氧化劑用量的增加使整個體系中氧化劑量比例增多，而CPO具有活性，在氧化劑濃度較高時，其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致活性位點暴露程度降低，催化性能減小.另外反應(yīng)過程中隨著反應(yīng)的進(jìn)行，部分H2O2發(fā)生分解生成水，不利于有機(jī)反應(yīng)的進(jìn)行.

2.2 pH對反應(yīng)的影響

在堿性環(huán)境中產(chǎn)率極低，根據(jù)實驗測定酶已失活，因此,后續(xù)確定實驗pH范圍3～7.結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，反應(yīng)最佳pH為5，當(dāng)pH低于5時，手性二氯丙醇的產(chǎn)率隨pH增大而增大，當(dāng)pH為5時R-2，3-DCP產(chǎn)率達(dá)到最大值45.3%，當(dāng)pH為6時，產(chǎn)物產(chǎn)率下降很快，當(dāng)pH為7時產(chǎn)率仍降低較快.實驗證明該反應(yīng)最適pH為5，這也跟CPO的本性有關(guān)，CPO在偏酸或偏堿環(huán)境中其結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，活性中心卟啉環(huán)受到影響，導(dǎo)致其整個結(jié)構(gòu)失活[10]，而在中性條件下，溶液中的底物溶解降低，也會導(dǎo)致產(chǎn)率下降，同時通過旋光儀測定證實在中性條件下會生成部分外消旋體，從而影響產(chǎn)率.

2.3 酶用量對合成反應(yīng)的影響

在確定pH條件后，考察氯過氧化物酶(CPO)用量對反應(yīng)產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖4所示，產(chǎn)物R-2，3-二氯-1-丙醇的產(chǎn)率隨酶濃度變化而不同，當(dāng)CPO用量逐漸增大時，產(chǎn)率逐漸提高，當(dāng)酶用量大于0.20 μmol時，R-2，3-二氯-1-丙醇的產(chǎn)率基本保持不變，其最高產(chǎn)率達(dá)到47.5% ，結(jié)合產(chǎn)率并從酶用量方面考慮確定最佳CPO用量為0.20 μmol.可見以CPO作催化劑合成該反應(yīng)體系，酶的用量極少，其具有潛在的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值.

504030201034567pHyield/%504030201004812time/hyield/%圖3 pH對反應(yīng)產(chǎn)率的影響圖4 CPO用量對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

2.4 反應(yīng)時間的影響

確定pH和酶用量后，考察反應(yīng)時間對CPO催化甘油合成R-2，3-二氯-1-丙醇的影響，結(jié)果如圖5所示.反應(yīng)開始，隨著時間的延續(xù)產(chǎn)率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行的時間為10 h時，R-2，3-二氯-1-丙醇的產(chǎn)率達(dá)到了最大值48.8%.其后隨反應(yīng)時間繼續(xù)延長，產(chǎn)物產(chǎn)率會逐漸降低.這是因為隨著時間的延長導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生聚合，從而降低了產(chǎn)率.因此為了保證獲得較高的產(chǎn)率，本體系確定最佳的反應(yīng)時間是10 h.該反應(yīng)與合成手性二氯丙醇的其他反應(yīng)相比，在反應(yīng)時間上還是有一定的優(yōu)勢.

2.5 溫度對反應(yīng)的影響

為了提高產(chǎn)率，應(yīng)用前面得到的條件，考察溫度對CPO催化甘油合成R-2，3-二氯-1-丙醇的影響，對實驗數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果如圖6.CPO在30℃時的活性最好，產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到50.3%.隨著溫度的升高，酶活性逐漸下降，導(dǎo)致產(chǎn)率降低，溫度的變化對該反應(yīng)產(chǎn)率影響較大.所以確定最佳反應(yīng)溫度為30℃.

504030201004812time/hyield/%555045403530153010202535yield/%Amountofenzyme/μmol4045圖5 反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響圖6 反應(yīng)溫度對產(chǎn)率的影響

2.6 季銨鹽對反應(yīng)的影響

CPO具有親水性，在有機(jī)溶劑中很不穩(wěn)定，容易失活.而大多數(shù)有機(jī)底物一般都難溶于水，導(dǎo)致CPO催化的有機(jī)合成反應(yīng)產(chǎn)率均不高.本實驗通過前面條件優(yōu)化后R-2，3-二氯-1-丙醇的產(chǎn)率也僅達(dá)到50.3%.為了提高反應(yīng)的產(chǎn)率，引入季銨鹽作為反應(yīng)體系的添加劑.該類添加劑是一種優(yōu)良的相轉(zhuǎn)移催化劑，與水相中的親核試劑組成離子對進(jìn)入有機(jī)相，從而加快反應(yīng)速率，減少副反應(yīng)并提高產(chǎn)率.本體系選用四甲基溴化銨(TMABr)、四乙基溴化銨(TEABr)、四丙基溴化銨(TPABr)和四丁基溴化銨(TBABr)作為添加劑，結(jié)果如圖7所示，可以看出加入季銨鹽后產(chǎn)率均提高，其中當(dāng)在體系中加入0.05 mol · L-1TMABr最高，產(chǎn)率達(dá)到了78.6 %，ee值也達(dá)到98.4 %.產(chǎn)率提高一方面與CPO本身的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，加入季銨鹽后改變了CPO內(nèi)部結(jié)構(gòu)上疏水性通道與氨基酸殘基之間的相互作用，使得CPO活性位點周圍產(chǎn)生了大量的疏水性環(huán)境，從而使CPO的活性位點和有機(jī)底物更容易鍵合，提高了CPO的催化活性；另一方面底物與季銨鹽端基間的靜電作用降低了反應(yīng)的活化能，從而更有利于反應(yīng)的進(jìn)行[11].從圖7可以看出，添加劑的疏水鏈越短，越容易接近通道，對CPO催化性能的激活度越高，所以當(dāng)加入TMABr作為添加劑時，R-2，3-二氯-1-丙醇的產(chǎn)率最高.

圖7 季銨鹽對磺化氧化反應(yīng)的影響

為了對加入添加劑后R-2，3-二氯-1-丙醇的產(chǎn)率提高的原因進(jìn)一步分析，實驗通過UV-Vis光譜儀對加入添加劑后CPO的構(gòu)象進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖8所示，CPO在紫外區(qū)的特征吸收峰為398 nm ，這是其結(jié)構(gòu)中血紅素輔基卟啉環(huán)產(chǎn)生的吸收帶，從該實驗測試的結(jié)果可以看出，當(dāng)加入季銨鹽時，卟啉環(huán)的吸收帶強(qiáng)度都增強(qiáng)，而在加入四甲基溴化銨時增強(qiáng)最為明顯，因為當(dāng)加入季銨鹽時，使CPO結(jié)構(gòu)中的血紅素輔基卟啉環(huán)活性中心更加暴露，從而紫外吸收強(qiáng)度增大，更有利于底物接近活性中心，使催化活性得到提高，從而使R-2，3-二氯-1-丙醇產(chǎn)率得到提高.

為了進(jìn)一步對CPO在添加劑中的構(gòu)象進(jìn)行分析，采用熒光分光光度計進(jìn)行光譜測試，結(jié)果如圖9所示，在不同季銨鹽溶液中CPO熒光光譜發(fā)生了變化，峰位沒有移動，說明此時分子中的肽鏈沒有伸展，氨基酸殘基周圍的極性沒有大的變化.但加入季銨鹽的溶液中的熒光強(qiáng)度都比純緩沖溶液中強(qiáng)，而熒光強(qiáng)度的大小表明CPO側(cè)鏈微環(huán)境的暴露程度，該強(qiáng)度增強(qiáng)表明當(dāng)加入添加劑季銨鹽時CPO結(jié)構(gòu)中的血紅素微環(huán)境發(fā)生了變化，這種變化使得α-螺旋結(jié)構(gòu)加強(qiáng)，從而CPO分子中的鐵卟啉環(huán)活性中心更易暴露在環(huán)境中，內(nèi)源性熒光活性增強(qiáng)，導(dǎo)致CPO的催化性能提高，從而提高了產(chǎn)率.

3 結(jié)論

該合成方法是以CPO為催化劑催化、過氧化氫(H2O2)氧化甘油制備得到R-2，3-二氯-1-丙醇，實驗中通過對工藝條件的優(yōu)化，又采用添加季銨鹽提高產(chǎn)率后，反應(yīng)體系最終產(chǎn)率和ee值分別可以達(dá)到78.6%和98.4%.與目前已有的合成方法相比，大大縮短了反應(yīng)時間.該方法以NaCl作為氯源，減少了污染，同時CPO酶促制備反應(yīng)快速又高效，并且酶用量極少，具有一定的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景.