曲雪，劉琦，趙鑫，邢元欣，郟雁飛，鄭燕，楊煒華，汪運(yùn)山，韓淑毅

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）研究生院，濟(jì)南 250117；2 山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院；3 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗診斷中心；4 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心；5 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院專科轉(zhuǎn)化研究中心

胃癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率分別居第四位、第三位，已成為嚴(yán)重威脅人類生命與健康的重大疾病之一。幽門螺桿菌（Hp）感染是目前最明確的胃癌致病因素［1］。細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（Cag A）是Hp 的重要毒力因子［2］。有研究報道，Cag A 陽性Hp 感染者胃癌的發(fā)病風(fēng)險是Cag A 陰性Hp感染者的兩倍［3］；Cag A能夠通過調(diào)控多種細(xì)胞信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并抑制其凋亡［4-5］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA 分子［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 能夠參與包括胃癌在內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而Hp 感染可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞中部分lncRNA 差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的lncRNA 可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［7］。淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2（DLEU2）屬于lncRNA 家族成員之一，定位于人類染色體13q14區(qū)域［8］。本課題組前期生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織DLEU2 異常表達(dá)，并且其異常表達(dá)可能與Hp感染有關(guān)［8］。2022年1月—7月，我們探討了Cag A 陽性Hp 對胃癌細(xì)胞lncRNA DLEU2 表達(dá)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞系HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 以及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1，購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。Hp NCTC標(biāo)準(zhǔn)菌株 26695、11637，由山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院賈繼輝博士惠贈。所有引物序列購自日本Ta?KaRa 公司。LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀，購自瑞士Roche公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，購自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。Cag A抗體，購自美國GeneTex公司；神經(jīng)鈣黏著蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH 一抗及其相應(yīng)二抗，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜上皮細(xì)胞DLEU2 表達(dá)檢測 將HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28、GES1細(xì)胞接種于含10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。待細(xì)胞貼壁生長至90%融合時，收集細(xì)胞。采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0、OD260/OD230≥2.0。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，按UltraSYBR Mixture 試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：DLEU2 上游引物5'-GGCGGCGGGTACTTATCTC-3'、下游引物5'-CCAGGGAAGGATGTAGCTGTG-3'，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'、下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。按試劑盒說明配制PCR 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、61 ℃ 1 min 共45 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算DLEU2 相對表達(dá)量。選擇DLEU2 相對表達(dá)量最高的胃癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

取2×107cfu/mL Cag A 陽性NCTC 26695、11637各100 μL，用一次性接種環(huán)均勻涂布于彎曲桿菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于85% N2、10% CO2、5% O2的三氣培養(yǎng)箱。培養(yǎng)3～5天，收集NCTC 26695、11637，加入1 mL無菌PBS 制成細(xì)菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷醿x檢測細(xì)菌懸液濁度。按照感染復(fù)數(shù)100∶1 將正常胃黏膜上皮細(xì)胞、胃癌細(xì)胞分別與NCTC 26695、11637 共培養(yǎng)。分別于共培養(yǎng)0、3、9、12 h，按上述步驟檢測DLEU2相對表達(dá)量。

1.3 Cag A、N-cadherin、Vimentin 表達(dá)檢測 收集與NCTC 26695 或11637 共培養(yǎng)3、9、12 h 時正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。加入上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，分別滴加Cag A 一抗及其內(nèi)參β-actin一抗以及N-cadherin、Vimentin一抗及其內(nèi)參GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG 二抗，室溫孵育45 min，ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 或GAPDH 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Student′s-t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜上皮細(xì)胞DLEU2 表達(dá)比較 GES1、HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 細(xì)胞DLEU2相對表達(dá)量分別為1.00 ± 0.12、3.69 ± 0.51、3.32 ± 0.26、3.17 ± 0.55、2.52 ± 0.19。HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量均高于GES1 細(xì)胞（P均＜0.05）。在胃癌細(xì)胞中，以HGC-27 細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量最高。因此，選擇HGC-27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 與NCTC 11637或26695共培養(yǎng)不同時間HGC-27細(xì)胞與GES1細(xì)胞DLEU2表達(dá)比較 見表1。

表1 與NCTC 11637或26695共培養(yǎng)不同時間HGC-27細(xì)胞與GES1細(xì)胞DLEU2相對表達(dá)量比較（±s）

表1 與NCTC 11637或26695共培養(yǎng)不同時間HGC-27細(xì)胞與GES1細(xì)胞DLEU2相對表達(dá)量比較（±s）

注：與同細(xì)胞同菌株共培養(yǎng)0 h 比較，*P＜0.05；與同細(xì)胞同菌株共培養(yǎng)3 h 比較，#P＜0.05；與同細(xì)胞同菌株共培養(yǎng)9 h 比較，△P＜0.05；與同細(xì)胞NCTC 26695菌株共培養(yǎng)同時間比較，▲P＜0.05；與GES1細(xì)胞同菌株共培養(yǎng)同時間比較，▽P＜0.05。

細(xì)胞GES1菌株DLEU2共培養(yǎng)9 h 3.21 ± 0.73*0.47 ± 0.04 1.12 ± 0.12▲1.05 ± 0.02#▽共培養(yǎng)3 h 1.97 ± 0.03*1.62 ± 0.58 0.70 ± 0.03▲▽1.25 ± 0.02 HGC-27共培養(yǎng)12 h 2.14 ± 0.04*#▲0.41 ± 0.00 1.52 ± 0.07*#▽0.59 ± 0.06#△NCTC 11637 NCTC 26695 NCTC 11637 NCTC 26695共培養(yǎng)0 h 1.00 ± 0.06 1.02 ± 0.25 0.93 ± 0.10 1.00 ± 0.17

2.3 與NCTC 11637或26695共培養(yǎng)不同時間HGC-27細(xì)胞和GES1細(xì)胞Cag A、N-cadherin、Vimentin表達(dá)比較 見表2。

表2 與NCTC 11637或26695共培養(yǎng)不同時間HGC-27細(xì)胞和GES1細(xì)胞Cag A、N-cadherin及Vimentin相對表達(dá)量比較（±s）

表2 與NCTC 11637或26695共培養(yǎng)不同時間HGC-27細(xì)胞和GES1細(xì)胞Cag A、N-cadherin及Vimentin相對表達(dá)量比較（±s）

注：與同細(xì)胞同菌株共培養(yǎng)3 h比較，*P＜0.05；與同細(xì)胞同菌株共培養(yǎng)9 h比較，#P＜0.05。

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2.4 與NCTC 11637 或26695 共培養(yǎng)HGC-27 細(xì)胞DLEU2、Cag A 表達(dá)與N-cadherin、Vimentin 表達(dá)的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，與NCTC 11637 共培養(yǎng)HGC-27 細(xì)胞DLEU2 表達(dá)與N-cadherin、Vimentin 表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.98、0.99，P均＜0.05），Cag A 表達(dá)與N-cadherin、Vimentin 表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.88、0.92，P均＜0.05），并且DLEU2 表達(dá)與Cag A 表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.93，P＜0.05）；與NCTC 26695 共培養(yǎng)HGC-27 細(xì)胞DLEU2表達(dá)與N-cadherin、Vimentin表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.98、0.91，P均＜0.05），Cag A 表達(dá)與N-cadherin、Vimentin 表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.93、0.98，P均＜0.05），并且DLEU2 表達(dá)與Cag A表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.83，P＜0.05）。

3 討論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤前列［1］。Hp 是一種可以長期定植于胃黏膜上皮的革蘭陰性桿菌，能夠引起胃黏膜病變，如萎縮、腸化、異型增生甚至癌變［9］。Hp 感染是目前最明確、最重要的胃癌致病因素［10］，但并非所有Hp 都會引起癌變。Cag A 陽性Hp菌株毒力較強(qiáng)，是胃炎、胃潰瘍、胃癌等疾病的主要致病菌株［11］。因此，明確Cag A 陽性Hp 對胃癌細(xì)胞中特異性分子表達(dá)的影響，將有助于更好地了解其致癌機(jī)制，從而為胃癌診斷與治療提供新的思路。

lncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA 分子［6］。相較于其他非編碼RNA，lncRNA 的生物學(xué)功能復(fù)雜，能夠調(diào)控其他基因以及非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白翻譯、翻譯后修飾等過程［12］。有研究報道，胃癌細(xì)胞中存在多種lncRNA 表達(dá)失調(diào)［9］。DLEU2 屬于lncRNA 家族成員之一，定位于人類染色體13q14 區(qū)域［8］。DLEU2 在多種惡性腫瘤中具有促癌作用，并且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織DLEU2 表達(dá)顯著升高，并且其異常表達(dá)與腫瘤病理分級和TNM 分期顯著相關(guān)［14］。有研究還發(fā)現(xiàn)，DLEU2 高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后較差密切相關(guān)［8］。HU 等［15］研究認(rèn)為，DLEU2 可通過調(diào)控PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量均顯著高于GES1 細(xì)胞，進(jìn)一步驗證了胃癌細(xì)胞中DLEU2 高表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，以HGC-27細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量最高。因此，選擇HGC-27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

雖然Hp感染是目前最明確的胃癌致病因素，但Hp 感染導(dǎo)致胃癌發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚［9］。本課題組前期生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織DLEU2異常表達(dá)，并且其異常表達(dá)可能與Hp 感染有關(guān)［8］。本研究結(jié)果顯示，NCTC 11637 感染3、9、12 h 時GES1 細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量均高于NCTC 11637感染0 h 時；NCTC 11637 感染12 h 時HGC-27 細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量高于NCTC 11637 感染0 h 時。結(jié)果提示，NCTC 11637 感染能夠促進(jìn)GES1 細(xì)胞和HGC-27 細(xì)胞DLEU2 表達(dá)。Hp 可分泌Cag A、Vac A等毒力因子，其中Cag A 陽性Hp 菌株能夠顯著增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險［16］。NCTC 26695 感染3、9、12 h 時GES1 細(xì)胞或HGC-27 細(xì)胞DLEU2 相對表達(dá)量與NCTC 26695感染0 h時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NCTC 11637 感染12 h HGC-27 細(xì)胞與GES1細(xì)胞Cag A相對表達(dá)量均高于NCTC 26695，提示DLEU2 表達(dá)差異與Hp 菌株進(jìn)入HGC-27 細(xì)胞或GES1 細(xì)胞中毒力因子Cag A 多少有關(guān)。NCTC 11637 感染GES1 細(xì)胞Cag A 相對表達(dá)量9 h＞12 h＞3 h；NCTC 26695 感染GES1 細(xì)胞Cag A 相對表達(dá)量3 h＞9 h＞12 h。NCTC 11637 感染HGC-27 細(xì)胞Cag A相對表達(dá)量12 h＞9 h＞3 h；NCTC 26695 感染HGC-27細(xì)胞Cag A 相對表達(dá)量3 h＞9、12 h。NCTC 11637、26695 感染12 h 內(nèi)Cag A 相對表達(dá)量變化與DLEU2相對表達(dá)量變化趨勢相同。Pearson相關(guān)分析顯示，與NCTC 11637 或26695 共培養(yǎng)的HGC-27 細(xì)胞和GES1細(xì)胞DLEU2表達(dá)與Cag A 表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。據(jù)報道，Cag A 可激活致癌信號通路，從而導(dǎo)致信號通路依賴的癌基因表達(dá)上調(diào)［5］，而DLEU2 亦可通過信號通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展。由此推測，Cag A 有可能通過上調(diào)DLEU2表達(dá)促進(jìn)胃癌進(jìn)展。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮表型細(xì)胞向間質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化賦予了細(xì)胞侵襲和遷移的能力，是胃癌進(jìn)展的重要原因。N-cadherin 和Vimentin 是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白［17］。有研究報道，Cag A 陽性Hp 可導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［4］，而DLEU2 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲［8］。本研究結(jié)果顯示，NCTC 11637 感染HGC-27細(xì)胞N-cadherin、Vimentin 相對表達(dá)量12 h＞9 h＞3 h；NCTC 26695 感染HGC-27 細(xì)胞N-cadherin、Vimentin相對表達(dá)量3 h＞9 h＞12 h。NCTC 11637 或26695 感染12 h 內(nèi)HGC-27 細(xì)胞N-cadherin、Vimentin 相對表達(dá)量變化與Cag A、DLEU2 相對表達(dá)量變化趨勢相同。Pearson 相關(guān)分析顯示，NCTC 11637 或26695 共培養(yǎng)的HGC-27 細(xì)胞DLEU2、Cag A 表達(dá)與N-cad?herin、Vimentin 表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系。提示Cag A陽性Hp 可能是推動DLEU2 影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要原因。

綜上所述，Cag A 陽性Hp 能夠引起胃癌細(xì)胞lncRNA DLEU2 異常表達(dá)，而DLEU2 異常表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。