程小龍，水寅萍

(皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

敗血癥是一種由病原微生物侵入體內(nèi)引起的全身性炎癥綜合征[1]。敗血癥的發(fā)病率高且死亡率高，因此是臨床研究的重要疾病之一[2]。敗血癥發(fā)生的過(guò)程中往往伴隨著脂多糖(LPS)的釋放，導(dǎo)致多種免疫細(xì)胞的激活和多種病理反應(yīng)，隨后引起組織器官的損傷和衰竭，其中心臟損傷和炎癥的發(fā)生是造成死亡的重要原因[3]。因此，尋找潛在的靶點(diǎn)預(yù)防敗血癥引起的心臟損傷十分必要。Vaspin是一種內(nèi)臟脂肪組織衍生的絲氨酸蛋白酶抑制劑[4]，主要來(lái)源于內(nèi)臟脂肪細(xì)胞，可在心臟、腎臟、大腦、胃腸道、胰腺等多種組織中表達(dá)[5]，炎癥、高糖等病理?xiàng)l件可促進(jìn)vaspin的合成和分泌[6]。研究發(fā)現(xiàn)vaspin可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達(dá)，且能對(duì)抗細(xì)胞凋亡，對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用[7]。激肽釋放酶可分為兩大類，分別為血漿激肽釋放酶(plasma kallikrein，PK)和組織激肽釋放酶(kallikrein related peptidase，KLK)[8]。組織激肽釋放酶中的激肽釋放酶7(KLK7)是一種具有胰凝乳蛋白酶樣特異性的蛋白酶，被確定為第一個(gè)vaspin靶蛋白酶，已有研究表明KLK7參與了機(jī)體炎癥的發(fā)生過(guò)程[9]。大量研究表明[10]，vaspin與心血管疾病之間存在關(guān)聯(lián)，冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)患者體內(nèi)的vaspin顯著增高，且與冠心病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]。Vaspin在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)也增加，并通過(guò)減輕炎癥逆轉(zhuǎn)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程[12]。然而，目前尚不清楚vaspin是否在膿毒癥引起的心臟損傷中起作用，本研究中使用盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)誘導(dǎo)的敗血癥小鼠來(lái)探究這一問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 C57野生型(WT)小鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：2022134628)。KLK7基因敲除(KLK7-/-)小鼠購(gòu)自GemPharmatech有限公司(江蘇，中國(guó))。LPS(sigma)溶解于生理鹽水中，稀釋終濃度為10 mg/kg，保存使用；vaspin(PeproTech)先溶解于DMSO中，后使用生理鹽水溶解，終濃度為0.1 μg/kg，保存使用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 多功能酶標(biāo)儀(北京市六一儀器廠)；熒光倒置顯微鏡(卡爾·蔡司公司)；高速冷凍離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器公司)；電泳設(shè)備(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建敗血癥模型 采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)和脂多糖(LPS)建立膿毒癥小鼠模型[13]。首先WT小鼠或 KLK7-/-小鼠用vaspin或PBS預(yù)處理，用2%異氟烷吸入麻醉，并平放在預(yù)熱的手術(shù)臺(tái)上，腹部的毛發(fā)用剃毛器去除，用75%的乙醇對(duì)皮膚進(jìn)行消毒。然后解剖腹部皮膚以暴露腹腔，盲腸在遠(yuǎn)端和盲腸底部之間的一半距離處被結(jié)扎，從盲腸前部的腸系膜末端穿刺一次，用26G針頭從腸系膜端向腸前方向穿刺一次。最后，縫合腹部皮膚并進(jìn)行消毒，將小鼠置于28 ℃的培養(yǎng)箱中。對(duì)模型組小鼠使用LPS(10 mg/kg)預(yù)給藥6 h，刺激小鼠炎癥發(fā)生，小鼠敗血癥模型構(gòu)建完成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 WT小鼠接受假手術(shù)或使用生理鹽水作為對(duì)照(n=15)。此外，在接受CLP或假手術(shù)之前，WT小鼠用PBS或vaspin(0.1 μg/kg)預(yù)處理30 min(n=15)，LPS(10 mg/kg)預(yù)給藥6 h；造模結(jié)束后觀察小鼠1周以確定其存活率。同樣對(duì)于KLK7-/-小鼠首先接受CLP或假手術(shù)(n=15)，小鼠使用vaspin或PBS預(yù)處理30 min(n=15)，LPS(10 mg/kg)預(yù)給藥6 h；給藥和CLP后觀察小鼠1周以確定其存活率。

1.2.3 超聲檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 給藥和CLP結(jié)束后，將各組小鼠麻醉并仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，氣管插管，使用小動(dòng)物呼吸機(jī)維持通氣，開胸，將PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)傳感器的針尖小心插入小鼠左心室內(nèi)，根據(jù)系統(tǒng)軟件檢測(cè)記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP) 、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP) 、左心室等容舒張期壓力下降最大速率(maximum rate of left ventricular isovolumic diastolic pressure drop，-dp/dtmax) 和左心室等容舒張期壓力上升最大速率(maximum rate of leftventricular isovolumic diastolic pressure rise，+dp/dtmax) ，每只小鼠至少需檢測(cè)3個(gè)連續(xù)且完整的心動(dòng)周期。

1.2.4 心臟損傷標(biāo)志物的分析 通過(guò)小鼠眼球取血的方式采集各組小鼠血液樣本并離心以獲得血清。使用LDH檢測(cè)試劑盒和CK-MB檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自中國(guó)Njjcbio生物技術(shù)公司)檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)和心肌結(jié)合肌酸激酶(CK-MB)，用以評(píng)估心臟損傷標(biāo)志物水平。

1.2.5 HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化 將被安樂(lè)死的小鼠解剖并分離其心肌組織，每組各取15只小鼠的心肌組織(其余心肌組織置于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)ELISA和Western Blot檢測(cè))迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用石蠟包埋，用切片機(jī)切成約5 mm厚的切片，參照HE染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，之后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析 將冷凍的組織研磨，用裂解緩沖液裂解，并通過(guò)超聲波進(jìn)一步裂解。通過(guò)離心獲得總蛋白質(zhì)，收集上清液。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，USA)檢測(cè)蛋白濃度。總蛋白使用12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠，按分子量進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，USA)。用3%的BSA封閉1 h后，將膜與稀釋好的vaspin、 KLK7 、Cleaved caspase3等抗體孵育過(guò)夜；PBS洗膜完成后，與二抗GAPDH室溫孵育1 h(所有單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)，最后上機(jī)顯影，并用Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.2.7 ELISA檢測(cè)心肌組織中炎癥因子水平 造模結(jié)束后取小鼠心肌組織，冰PBS漂洗后制備心肌組織勻漿，按ELISA試劑盒要求檢測(cè)心肌組織中IL-1β和TNF-α的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 超聲檢測(cè)各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)情況 MAP、LVSP、-dp/dtmax和+dp/dtmax：CLP處理組較假手術(shù)組顯著降低；vaspin預(yù)處理組較CLP處理組顯著升高；KLK7基因敲除組的小鼠CLP處理后較正常CLP處理組小鼠升高得更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較

2.2 各組LDH和CK-MB檢測(cè)情況 與假手術(shù)組相比，CLP組的LDH和CK-MB水平顯著升高；vaspin預(yù)處理組相較于CLP組LDH和CK-MB水平顯著降低；基因敲除組相較于CLP組LDH和CK-MB水平降低得更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 HE染色觀察各組心肌組織病理學(xué)變化情況 HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維橫紋清晰，無(wú)變質(zhì)、壞死等異常改變；CLP處

表2 各組小鼠血清LDH和CK-MB水平比較 單位：μg/L

理組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見心肌細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞核碎裂、溶解，心肌纖維斷裂，心肌橫紋模糊、消失、間質(zhì)水腫等異常變化；vaspin預(yù)處理組可見心肌損傷情況明顯好轉(zhuǎn)；而基因敲除組可見小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)趨于正常，異常變化得到改善。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織病理學(xué)HE染色圖(×200)

2.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CLP處理組的vaspin、KLK7、Cleaved caspase3、TNF-α和IL-6的表達(dá)均顯著上調(diào)；而與CLP組相比，vaspin預(yù)處理的CLP組KLK7、Cleaved caspase3、TNF-α和IL-6表達(dá)顯著下調(diào)；當(dāng)KLK7被敲除時(shí)，與CLP組相比，KLK7、Cleaved caspase3、TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著下調(diào)。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織vaspin、KLK7和Cleaved caspase3等蛋白表達(dá)結(jié)果

2.5 ELISA檢測(cè)各組小鼠心肌組織中炎癥因子水平 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CLP處理后小鼠體內(nèi)的TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平上升；將vaspin預(yù)處理后再CLP處理時(shí)，與單純CLP處理組相比，小鼠體內(nèi)的TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平下降；當(dāng)敲除KLK7后，小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平也下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

敗血癥是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，是由細(xì)菌和其他致病微生物侵入體內(nèi)引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征[14]。敗血癥在臨床上病情進(jìn)展迅速、臨床救治困難，心肌損傷是敗血癥常見的早期并發(fā)癥[15]，一旦發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)心血管疾病，極大可能發(fā)生死亡，因此研究如何預(yù)防敗血癥的發(fā)生和惡化顯得尤為必要。

圖3 各組小鼠體內(nèi)TNA-α、IL-6等炎癥因子水平

在本次研究中小鼠接受了CLP誘導(dǎo)腹部感染，模擬臨床敗血癥，同時(shí)腹腔注射LPS，以模擬革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁釋放LPS的情況[16]。小鼠通過(guò)接受CLP處理并注射LPS以建立敗血癥模型。以前的研究發(fā)現(xiàn)[17]，vaspin是急性心肌梗死患者心衰的一個(gè)重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。本次研究主要探究絲氨酸蛋白酶抑制劑vaspin在敗血癥誘發(fā)的小鼠心臟損傷中的保護(hù)作用，并深入探究其保護(hù)機(jī)制。首先實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)對(duì)小鼠進(jìn)行vaspin預(yù)給藥時(shí)，能夠有效地保護(hù)敗血癥誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙和損傷。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，vaspin預(yù)給藥可以有效降低小鼠體內(nèi)的相關(guān)炎癥因子水平，抑制心肌細(xì)胞的凋亡。PAHLAVANI N等[18]在敗血癥患者和小鼠體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)了血液中的各種免疫細(xì)胞，包括白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，它們的水平都明顯增加。此外，這些免疫細(xì)胞逐漸浸潤(rùn)心臟并被激活，從而釋放出多種因子，放大了心臟的炎癥反應(yīng)[19]。這些發(fā)現(xiàn)表明，炎癥在敗血癥的發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用。盡管其他病理因素包括氧化應(yīng)激反應(yīng)等也參與了敗血癥損傷機(jī)體的過(guò)程[20]，但敗血癥引發(fā)的炎癥極大可能是敗血癥導(dǎo)致心臟損傷的主要原因。那么vaspin究竟是通過(guò)什么機(jī)制發(fā)揮其保護(hù)作用的，是課題研究的主要問(wèn)題。KLK7是組織激肽釋放酶中的重要一員，可以在各種組織和器官中表達(dá)。研究表明，KLK7參與了多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生，包括皮膚病、腫瘤和前列腺炎[21]。同時(shí)KLK7是vaspin的第一個(gè)下游信號(hào)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)預(yù)給藥vaspin再進(jìn)行CLP處理時(shí)，小鼠體內(nèi)的KLK7蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)相關(guān)炎癥蛋白和凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著升高。因此，推測(cè)vaspin是通過(guò)抑制KLK7表達(dá)發(fā)揮其保護(hù)作用的。隨后敲除了KLK7基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CLP處理后小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平并沒(méi)有升高，凋亡蛋白的表達(dá)也沒(méi)有明顯上調(diào)。同時(shí)當(dāng)KLK7被敲除后，CLP小鼠的心功能障礙得到一個(gè)明顯的保護(hù)。

本研究證實(shí)vaspin通過(guò)抑制KLK7的表達(dá)來(lái)減輕敗血癥誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷和心臟炎癥，并且能夠緩解敗血癥引起心臟功能障礙。因此vaspin和KLK7可能是預(yù)防和治療臨床敗血癥中心臟損傷的重要治療靶點(diǎn)。