陳公安 王 剛 王賀玲 張 偉

(ThePracticalJournalofCancer,2023,38:0011～0015)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)約占所有癌癥病例和死亡人數(shù)的10%，并且5年生存率低于50%[1]。外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)療法是治療CRC的基石，但放射抗性的存在是CRC治療的一大障礙[2]。在過去的幾十年中，發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)是CRC發(fā)病、進(jìn)展和放射抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑或潛在生物標(biāo)志物[3-4]。miRNA是一類小的非編碼RNA，包含18～24個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后起調(diào)節(jié)劑的作用。最近基于miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物標(biāo)志物預(yù)測結(jié)直腸癌對新輔助放化療的反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-371a-5p可用于預(yù)測CRC對術(shù)前放化療的反應(yīng)，且miR-371a-5p在結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)[5]。然而，miR-371a-5p對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞放射敏感性的影響及機(jī)制仍不十分清楚。miRNA通常通過與靶基因的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)特異性結(jié)合而導(dǎo)致翻譯抑制或RNA降解，參與調(diào)節(jié)不同癌癥的放射反應(yīng)，以增加敏感性或保護(hù)細(xì)胞免受放射作用[6]。B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因3(B-cell translocation gene 3，BTG3)屬于ErbB2家族成員，據(jù)報道，BTG3是候選的腫瘤抑制劑，其可抑制細(xì)胞增殖和遷移，并調(diào)節(jié)腫瘤的細(xì)胞周期進(jìn)程[7]。有研究顯示，缺氧誘導(dǎo)的BTG3的下調(diào)賦予了對CRC放射治療的抵抗力[8]。本研究前期通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BTG3是miR-371a-5p的潛在靶基因。因此，本研究旨在研究miR-371a-5p靶向BTG3對CRC細(xì)胞放射敏感性的影響，以期為增強(qiáng)CRC患者放療敏感性提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗(美國Gibco)；RNA提取試劑盒(北京索萊寶)；SYBRTMGreen Master Mix試劑盒和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛生物)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(大連寶生物)；miR-371a-5p mimics、mimics control、miR-371a-5p inhibitors、inhibitors control、BTG3 siRNA、siRNA control、BTG3-Wt和BTG3-Mut重組熒光素酶報告基因載體質(zhì)粒(上海吉瑪制藥)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega)；BTG3單抗和IgG二抗(北京中杉金橋生物)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海碧云天)；CCK-8(日本同仁)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和雙抗(100 U/mL青-鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況更換新鮮培養(yǎng)液，采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)期的HT-29細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h種植到24孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至60%匯合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。使用opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋BTG3 siRNA、siRNA control、miR-371a-5p inhibitors、inhibitors control，另外，采用等量opti-MEM培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，均孵育5 min，隨后將兩種混合物混勻，室溫孵育20 min，將混合液添加到24孔板細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后更換成完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。其中轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors的HT-29細(xì)胞記為anti-miR-371a-5p組，轉(zhuǎn)染inhibitors control的HT-29細(xì)胞記為anti-miR-NC組，共轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors和BTG3 siRNA的HT-29細(xì)胞記為anti-miR-371a-5p+si-BTG3組，轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors和siRNA control的HT-29細(xì)胞記為anti-miR-371a-5p+si-NC組。轉(zhuǎn)染48 h后采用qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 qPCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-371a-5p的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h后anti-NC組和anti-miR-371a-5p組各組HT-29細(xì)胞，根據(jù)說明手冊，使用RNA提取試劑盒從各組HT-29細(xì)胞中提取總RNA，即收集約106個細(xì)胞，向細(xì)胞中加入1 mL細(xì)胞裂解液，室溫孵育5 min，再加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃ 12000 rpm離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，洗滌后加無酶ddH2O溶解，即得到RNA。然后，按照制造商的說明，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，向無酶離心管中加入2 μg總RNA，2 μL Oligo(dT)引物，加無酶ddH2O至14.5 μL，70 ℃孵育5 min，取出冰上冷卻2 min，向離心管中加入4 μL 5×M-MLV Buffer、1 μL dNTPs、0.5 μL Rnasin、1 μL M-MLV，42 ℃孵育60 min，待反應(yīng)完成取出產(chǎn)物，并使用SYBRTMGreen Master Mix進(jìn)行qPCR分析，反應(yīng)體系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL、上下游引物各1 μL，cDNA 4 μL加ddH2O至20 μL，程序設(shè)為：95 ℃熱啟動10 min，隨后設(shè)40個循環(huán)，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。以U6作為內(nèi)部對照，采用2-ΔΔCt法量化miR-371a-5p的表達(dá)。引物序列如下：miR-371a-5p F 5'-ACTCAAACTGTGGGGGCACT-3'；R 5'-CAGCCGCCACTCAAACTGTGGGG-3'；U6 F 5'-GCAAGGATGACACGCAAATTC-3'；R 5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以5×103個/孔接種到96孔板中，并在37 ℃下孵育24 h。以模擬照射(0 Gy)或4 Gy X射線照射后，將10 μL的CCK-8溶液添加到每個孔中，孵育3 h。最后，在450 nm處測定細(xì)胞吸光度(OD)值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以5×103個/孔接種到96孔板中，并在37 ℃下孵育24 h，以模擬照射(0 Gy)或4 Gy X射線照射后，收集約106個細(xì)胞，采用400 μL binding buffer重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中分別加入5 μLAnnexin V-FITC和PI染液，室溫避光孵育20 min，再向細(xì)胞懸液中加入100 μL binding buffer，立即使用流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞凋亡率。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的放射敏感性

將轉(zhuǎn)染的各組HT-29細(xì)胞以5×103個/孔接種于6孔板中，并在37 ℃下孵育24 h。模擬照射(0 Gy)或用不同劑量(2、4、6、8、8 Gy)的X射線照射后，將細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)約2周，待克隆形成，將菌落用4%多聚甲醛固定15 min，并用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，最后，計數(shù)包含50個以上細(xì)胞的陽性菌落的數(shù)量，分析細(xì)胞存活率。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

將生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測的含有miR-371a-5p靶位點(diǎn)的BTG3的3'UTR部分序列及含突變位點(diǎn)的序列亞克隆到psiCHECK-2載體中，分別構(gòu)建BTG3-Wt和BTG3-Mut重組載體質(zhì)粒。然后將重組載體分別miR-371a-5p mimics或mimics control共轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞。48 h后，收集細(xì)胞并用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)裂解細(xì)胞以進(jìn)行熒光素酶活性測定。

1.8 Western blot檢測BTG3的表達(dá)水平

使用補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物的預(yù)冷RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，將細(xì)胞在4 ℃下以12 000 rpm離心15 min，收集含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞上清液。通過BCA蛋白質(zhì)測定法確定蛋白質(zhì)濃度，向蛋白質(zhì)中加入等體積上樣緩沖液，沸水浴加入10 min致蛋白變性。隨后，通過SDS-PAGE電泳分離每個泳道中的30 μg蛋白質(zhì)樣品，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜電壓120 V，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，采用TBST洗膜3次，每次15 min，將膜與抗BTG3的一抗(1∶800稀釋)在4 ℃孵育過夜，采用TBST洗膜3次，每次15 min，在室溫下用標(biāo)記有辣根過氧化物酶(HRP)的二抗室溫孵育1 h。采用TBST洗膜3次，每次15 min，使用ECL底物將蛋白質(zhì)信號可視化，使用Image J軟件進(jìn)行定量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors的干擾效果

qPCR檢測轉(zhuǎn)染48 h各組HT-29細(xì)胞中miR-371a-5p的表達(dá)水平，與anti-NC組相比，anti-miR-371a-5p組中miR-371a-5p的表達(dá)水平明顯下降(1.00±0.09 vs 0.35±0.04，t=11.431，P<0.05)。

2.2 下調(diào)miR-371a-5p或/和照射對HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響

如圖1和表1，與anti-NC組相比，anti-miR-371a-5p組、4 Gy組和4 Gy+anti-miR-371a-5p組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與anti-miR-371a-5p組相比，4 Gy+anti-miR-371a-5p組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)；與4 Gy組相比，4 Gy+anti-miR-371a-5p組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測HT-29細(xì)胞凋亡率

表1 各組HT-29細(xì)胞OD值和凋亡率比較

2.3 下調(diào)miR-371a-5p對HT-29細(xì)胞放射敏感性的影響

如表2，與anti-NC組相比，anti-miR-371a-5p組細(xì)胞在接受2、4、6、8 Gy劑量X射線照射后細(xì)胞存活率均明顯降低(P<0.05)，提示下調(diào)miR-371a-5p能夠增加HT-29細(xì)胞的放射敏感性。

表2 X射線對下調(diào)miR-371a-5p的HT-29細(xì)胞存活率的影響

2.4 miR-371a-5p靶向負(fù)調(diào)控BTG3

如圖2和表3，生物信息學(xué)在線軟件TargetScan分析miR-371a-5p和BTG3 3'UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，共轉(zhuǎn)染BTG3-Wt的miR-371a-5p組細(xì)胞相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染BTG3-Mut的miR-371a-5p組細(xì)胞相對熒光素酶活性無明顯改變(P>0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與anti-NC組相比，anti-miR-371a-5p組細(xì)胞中BTG3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖3、表4。

圖2 生物信息學(xué)預(yù)測miR-371a-5p和BTG3的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶檢測系統(tǒng)鑒定細(xì)胞的相對熒光素酶活性

圖3 Western blot檢測各組HT-29細(xì)胞中BTG3的表達(dá)

表4 各組HT-29細(xì)胞中BTG3表達(dá)水平比較

2.5 抑制BTG3對HT-29細(xì)胞放射敏感性的影響

為驗(yàn)證miR-371a-5p靶向BTG3調(diào)控HT-29細(xì)胞的放射敏感性，本實(shí)驗(yàn)在HT-29細(xì)胞中同時抑制miR-371a-5p和BTG3，將共轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors和BTG3 siRNA的HT-29細(xì)胞記為anti-miR-371a-5p+si-BTG3組，轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors和siRNA control的HT-29細(xì)胞記為anti-miR-371a-5p+si-NC組，隨后以4 Gy的射線照射，結(jié)果如圖4和表5，與4 Gy+anti-miR-371a-5p+si-NC組相比，4 Gy+anti-miR-371a-5p+si-BTG3組HT-29細(xì)胞增殖能力升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率上升(P<0.05)，可見抑制BTG3降低了HT-29細(xì)胞的放射敏感性。

表5 各組HT-29細(xì)胞OD值、凋亡率和細(xì)胞存活率比較

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率

3 討論

CRC是世界上最常見的癌癥之一，對人類健康和生命構(gòu)成巨大威脅，每年估計有180萬新病例和90萬例死亡[9]。新輔助療法放療是局部晚期CRC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療策略，然而許多CRC患者具有放射抵抗性，預(yù)后較差[10]。因此，對與放射抵抗有關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行深入了解有助于改善放射治療的結(jié)果。miRNA通常通過結(jié)合靶基因的3'-UTR引起翻譯抑制。越來越多的證據(jù)表明，miRNA的表達(dá)失活與腫瘤放射抗性之間密切相關(guān)[11]。例如，miR-142-3p在體外可減弱乳腺癌干細(xì)胞的特性并降低其放射抗性[12]。外泌體miR-93-5p通過下調(diào)FOXA1和上調(diào)TGFB3的表達(dá)降低CRC細(xì)胞的放射抗性[13]。miR-107增強(qiáng)了輻射誘導(dǎo)的G1/S期細(xì)胞周期阻滯，并通過抑制p21和CHK2的磷酸化來抑制凋亡，該研究結(jié)果提示miR-107介導(dǎo)的GRN調(diào)節(jié)對電離輻射的應(yīng)答，并可能促進(jìn)前列腺癌治療的治療策略[14]。有研究發(fā)現(xiàn)在抗輻射的CRC細(xì)胞系中失調(diào)了一些miRNA，這些miRNA的上調(diào)或下調(diào)可以保護(hù)細(xì)胞免受輻射作用[15]。但是，需要更多新穎的miRNA生物標(biāo)志物來闡明CRC放射抗性的潛在機(jī)制。

已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-371a-5p在某些惡性腫瘤中與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和放射抵抗密切相關(guān)[16]。同樣，Zhu等[5]的研究表明，miR-371a-5p在CRC中表達(dá)上調(diào)，且可以作為CRC細(xì)胞放化療抗性的調(diào)節(jié)劑，而其對CRC細(xì)胞放射敏感性的影響和機(jī)制尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)以CRC細(xì)胞HT-29為研究對象，通過轉(zhuǎn)染miR-371a-5p inhibitors干擾miR-371a-5p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾miR-371a-5p的表達(dá)后，HT-29細(xì)胞增殖能力降低，凋亡率升高，且對放射的敏感性增加。這些結(jié)果表明，抑制miR-371a-5p能夠有效提高HT-29細(xì)胞的放射敏感性。此外，本實(shí)驗(yàn)通過TargetScan在線網(wǎng)站進(jìn)行的生物信息學(xué)分析顯示，BTG3和miR-371a-5p之間存在互補(bǔ)位點(diǎn)，表明BTG3是miR-371a-5p的潛在靶標(biāo)。據(jù)報道，BTG3是ErbB2家族成員，與某些癌癥(例如食管癌和宮頸癌等)的腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和放射抵抗有關(guān)[17-18]。此外，miR-371a-5p在CRC中的表達(dá)明顯升高，而BTG3在CRC細(xì)胞系和患者腫瘤樣品中被下調(diào)。另外，BTG3在低氧誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞的輻射抵抗中起著至關(guān)重要的作用[19]。這些研究結(jié)果提示，miR-371a-5p可能通過靶向負(fù)調(diào)控BTG3的表達(dá)參與CRC細(xì)胞對放射敏感性的影響。在HT-29細(xì)胞中通過抑制miR-371a-5p和BTG3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制BTG3能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-371a-5p對HT-29細(xì)胞放射敏感性的提高。這就證實(shí)了下調(diào)miR-371a-5p是通過上調(diào)BTG3的表達(dá)增加HT-29細(xì)胞的放射敏感性。

總之，本實(shí)驗(yàn)證明了干擾miR-371a-5p通過直接相互作用促進(jìn)BTG3的表達(dá)，提高CRC細(xì)胞的放射敏感性。本研究提供了對miR-371a-5p在調(diào)節(jié)CRC腫瘤發(fā)生和放射抵抗中的作用和分子基礎(chǔ)的深刻見解，并提出了miR-371a-5p在CRC的預(yù)后、治療和放射抵抗中的潛在價值。但是，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論需要通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。