陳育才

福建省南安市豐州鎮(zhèn)鄉(xiāng)村振興服務(wù)中心，福建 泉州362333

茶氨酸是茶樹的特征性氨基酸，是茶樹體內(nèi)最重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫、松弛神經(jīng)緊張等生理活性作用[1-2]，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[3-4]。

水楊酸是一種普遍存在于植物體內(nèi)的小分子酚類化合物，可調(diào)節(jié)植物的各種代謝途徑[5-6]，外源水楊酸提高植物抗性的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展[7-9]。董磊等[10]研究表明，外源水楊酸能通過提高葉綠素含量和過氧化物酶（POD）活性等方式有效緩解高溫脅迫對(duì)金花菜的生理影響。在淹水脅迫下，外源水楊酸可提高活性氧清除系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）和POD的活性，提高可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量，降低電解質(zhì)滲漏率和丙二醛（MDA）含量，從而增強(qiáng)辣椒幼苗耐淹水脅迫的能力[11]；在干旱脅迫下，外源水楊酸可有效改善鳳仙花的生長(zhǎng)發(fā)育，保護(hù)光合色素，提高抗氧化酶活性，上調(diào)P5CS、P5CR基因表達(dá)及促進(jìn)脯氨酸合成，從而降低干旱脅迫導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和氧化損傷[12]；外源水楊酸能顯著緩解干旱脅迫下大豆凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、實(shí)際光合效率、用于代謝的能量、氮代謝關(guān)鍵酶活性和抗氧化酶活性的下降，降低干旱脅迫下用于米勒反應(yīng)和熱耗散的能量，減少葉片過氧化氫含量，緩解干旱脅迫下的光抑制，提高大豆對(duì)干旱脅迫的抗性[13]；水楊酸浸種對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用[14]；水稻在受到水楊酸誘導(dǎo)后，激活了水稻體內(nèi)的多種防衛(wèi)反應(yīng)、促進(jìn)了水稻的病程相關(guān)基因的表達(dá)，組蛋白乙?；揎椝教岣?，從而使水稻幼苗稻瘟病抗性提高，即產(chǎn)生了誘導(dǎo)抗性[15]。

目前，很多學(xué)者主要集中研究茶樹栽培方式、外源氮肥、微量元素等方面的調(diào)節(jié)對(duì)茶氨酸代謝的影響[16-17]，而使用外源水楊酸調(diào)節(jié)茶氨酸代謝的研究尚未見報(bào)道。本研究以適制烏龍茶品種鐵觀音幼苗為試材，采用不同濃度的水楊酸對(duì)2年生盆栽幼苗進(jìn)行葉面噴施，分析水楊酸對(duì)茶樹光合性能、抗氧化特性、茶氨酸代謝途徑相關(guān)酶基因表達(dá)的影響，從而為茶樹高質(zhì)量栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2年生烏龍茶品種鐵觀音幼苗為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)在安溪縣茶葉科學(xué)研究所生產(chǎn)基地內(nèi)進(jìn)行。茶樹幼苗種植于花盆中，生長(zhǎng)健壯，地徑1.1 cm左右，植株高85 cm左右，每盆種植2株，每盆裝土4.5 kg；預(yù)培養(yǎng)1個(gè)月后，選擇長(zhǎng)勢(shì)相似的幼苗作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2019年4—5月對(duì)茶苗葉面噴施水楊酸，設(shè)置4個(gè)噴施濃度：1.0 mmol/L（處理1）、2.0 mmol/L（處理2）、3.0 mmol/L（處理3）和4.0 mmol/L（處理4），以噴施蒸餾水為對(duì)照（CK），共5個(gè)處理，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，各處理間距離30 cm。葉面噴施于上午9：00前進(jìn)行，噴施適度為所有葉片滴液，同時(shí)噴施等量蒸餾水作為對(duì)照處理；每隔1周噴施1次，共噴施4次；試驗(yàn)期間為防止自然降水影響，設(shè)置適當(dāng)避雨設(shè)施。試驗(yàn)期滿，分別取樣各處理與對(duì)照植株的同方向、同節(jié)位枝條上的根頸部以上第三片成熟葉片，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生化檢測(cè)

參照《茶游離氨基酸總量的測(cè)定》（GB/T 8314—2013）測(cè)定茶氨酸含量，比色法測(cè)定MDA含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量，比色法測(cè)定POD活性，分光光度法測(cè)定葉綠素含量，水浴浸提法測(cè)定脯氨酸含量，蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[18]。

1.3.2 茶樹茶氨酸代謝途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)

采用RNA提取試劑盒提取RNA；以茶樹葉片總RNA為模板，采用Perfect Real Time合成cDNA；以cDNA為模板，熒光定量分析采用SYBR Premix Ex Taq TMII試劑盒，引物由上海生工公司合成，引物系列設(shè)計(jì)見表1。

表1 相關(guān)酶基因引物序列

選擇茶樹GADPH作為內(nèi)參基因，每個(gè)對(duì)照基因樣品和內(nèi)參基因樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)及1個(gè)對(duì)照（陰性），觀察溶解曲線及擴(kuò)增曲線，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗光合性能的影響

不同濃度的外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗葉綠素、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量均有不同程度影響。由表2可見，鐵觀音幼苗的葉綠素含量隨著外源水楊酸濃度的提高呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在水楊酸濃度為3.0 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，且與對(duì)照差異顯著，比對(duì)照增加30.28%；鐵觀音幼苗的蛋白質(zhì)含量在噴施外源水楊酸后均有提高，其中水楊酸濃度1.0～3.0 mmol/L處理的蛋白質(zhì)含量顯著高于對(duì)照，但處理間差異不顯著；可溶性糖含量當(dāng)水楊酸

表2 外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗光合性能的影響mg/g

濃度3.0 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，且與對(duì)照差異顯著，比對(duì)照增加49.74%，水楊酸濃度4.0 mmol/L時(shí)可溶性糖含量略微下降，但仍顯著高于對(duì)照。

2.2 外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗抗氧化特性的影響

POD、MDA和脯氨酸為植物抗氧化特性的主要指標(biāo)。由表3可見，隨著外源水楊酸濃度的升高，鐵觀音幼苗POD活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，水楊酸濃度為3.0 mmol/L時(shí)POD活性達(dá)到最大值，與對(duì)照差異顯著，比對(duì)照增加69.29%；MDA含量在水楊酸濃度為2.0～4.0 mmol/L時(shí)顯著低于對(duì)照，并隨著水楊酸濃度的提高而下降；脯氨酸含量在噴施外源水楊酸后均有不同程度下降，但只有處理3與對(duì)照差異顯著。

表3 外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗抗氧化特性的影響

2.3 外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗茶氨酸含量的影響

茶氨酸是茶樹體內(nèi)特有的氨基酸，不僅是茶的主要呈味物質(zhì)，也是其主要功能成分，可以改善人體免疫功能，提高抵抗力等。經(jīng)外源水楊酸處理后，茶氨酸含量隨著水楊酸濃度的提高出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象（圖1）；水楊酸濃度為2.0 mmol/L和3.0 mmol/L時(shí)，茶氨酸含量顯著高于對(duì)照；水楊酸濃度為4.0 mmol/L時(shí)茶氨酸含量降低，且顯著低于對(duì)照。由此可見，水楊酸對(duì)茶氨酸的生成具有濃度效應(yīng)，低于3.0 mmol/L時(shí)促進(jìn)茶氨酸生成，高于3.0 mmol/L時(shí)則抑制茶氨酸生成。

圖1 水楊酸濃度對(duì)鐵觀音幼苗茶氨酸含量的影響

2.4 外源水楊酸處理對(duì)鐵觀音幼苗茶氨酸代謝途徑相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

茶氨酸合成代謝途徑基因包括直接參與合成的茶氨酸合成酶基因和茶氨酸水解酶基因，還包括谷氨酸合成相關(guān)的基因及茶氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因。谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、谷氨酸合成酶（CSGS）和茶氨酸合成酶（TS）是茶氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶。由圖2可見，水楊酸處理的GDH和TS1的基因表達(dá)量均高于對(duì)照，且隨著水楊酸濃度增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)水楊酸濃度為3.0 mmol/L時(shí)GDH和TS1的基因表達(dá)量均達(dá)到最大值。CSGS基因表達(dá)量隨著水楊酸濃度的增加而逐漸降低，當(dāng)水楊酸濃度為1.0 mmol/L時(shí)基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照，當(dāng)水楊酸濃度為2.0～3.0 mmol/L時(shí)基因表達(dá)量與對(duì)照差異不顯著，當(dāng)水楊酸濃度為4.0 mmol/L時(shí)基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照。

圖2 不同水楊酸濃度處理對(duì)CSGS、GDH、TS1表達(dá)量的影響

水楊酸處理的GS和TS2的基因表達(dá)量均高于對(duì)照，且隨著水楊酸濃度增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)水楊酸濃度為2.0 mmol/L、3.0 mmol/L時(shí)GS和TS2的基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，且當(dāng)水楊酸濃度為3.0 mmol/L時(shí)GS和TS2的基因表達(dá)量均達(dá)到最高值（圖3）。

圖3 不同水楊酸濃度處理對(duì)GS、TS2表達(dá)量的影響

3 小結(jié)與討論

水楊酸在植物代謝生理中起著重要的作用，能夠促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，降低膜脂過氧化作用，提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，以緩解環(huán)境脅迫對(duì)植物造成的傷害[19]。水楊酸可以通過提高植物的抗氧化活性對(duì)植物體內(nèi)的信號(hào)通道產(chǎn)生影響[20]。前人研究表明，半夏植株噴施0.5 mmol/L水楊酸后，葉綠素含量和塊莖鮮質(zhì)量顯著增加，植株MDA含量降低，SOD保護(hù)酶活性提高[21]。甜櫻桃采收期噴施0.5 mmol/L水楊酸，果實(shí)的色澤、硬度、可溶性固形物、總酚酸含量，以及保護(hù)酶活性顯著提高[22]。水楊酸雖能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，但高濃度的水楊酸處理或內(nèi)源水楊酸的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生氧化脅迫傷害，表現(xiàn)出抑制作用[23]。本試驗(yàn)中噴施3.0 mmol/L水楊酸處理的鐵觀音幼苗葉綠素、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量均顯著增加，脯氨酸和MDA含量顯著降低，POD活性顯著提高。而較高濃度的水楊酸明顯抑制鐵觀音幼苗的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出輕微的毒害作用。這可能是由于葉面噴施水楊酸后，植物體內(nèi)防御機(jī)制被啟動(dòng)，導(dǎo)致參與防御反應(yīng)的相關(guān)酶活性升高。

水楊酸是植物抗逆的內(nèi)源信號(hào)物，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)某些次生代謝產(chǎn)物的生物合成[24-26]。本研究中噴施3.0 mmol/L水楊酸對(duì)茶樹茶氨酸含量的增加具有促進(jìn)作用，而較高濃度的水楊酸明顯抑制茶氨酸生物生成。

茶氨酸的生物合成也受到茶氨酸合成代謝途徑基因表達(dá)的調(diào)控[27]。林鄭和等[28]比較茶氨酸含量不同的茶樹種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在高茶氨酸種質(zhì)中GDH基因表達(dá)顯著增強(qiáng)。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)干旱導(dǎo)致茶氨酸含量降低，其中GS、CSGS等基因表達(dá)下降，同時(shí)茶氨酸水解酶基因表達(dá)水平升高。本研究中，GDH和TS1對(duì)茶氨酸合成代謝起到主要作用，適宜濃度的外源水楊酸有利于提高茶氨酸的積累。目前，雖然部分參與茶氨酸合成代謝的關(guān)鍵酶基因已被克隆，但對(duì)于該代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚；外源信號(hào)物對(duì)茶氨酸代謝調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。