唐杰 龍湍 吳春瑜 李新鵬 曾翔 吳永忠 黃培勁

（1海南波蓮水稻基因科技有限公司, ?？?510125; 2海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院, ?？?510125; *通信聯(lián)系人, email: jesontom@126.com）

水稻（Oryza sativaL.）是雌雄同花自花授粉作物。雄性不育（male sterility，MS）是指雌性器官發(fā)育正常，而雄性器官由于發(fā)育退化或不能產(chǎn)生有功能的花粉或雄配子從而失去生殖功能導(dǎo)致不育的特性[1]，它是水稻的一種生理現(xiàn)象，也是作物雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，在自然界中發(fā)生的概率僅為0.13%[2]。早在1876年，達(dá)爾文就提出作物雜交后代部分農(nóng)藝性狀有超越親本的表現(xiàn)[3]。1926年，美國農(nóng)學(xué)家Jones提出水稻也具有雜種優(yōu)勢[4]。1973年，石明松[5]在晚粳農(nóng)墾58中發(fā)現(xiàn)了3株光溫敏雄性不育株，隨后育成了農(nóng)墾58S[6]，這一新成果為雜交水稻從“三系法”過渡到“兩系法”開拓了新局面。粳稻品種農(nóng)墾58S和秈稻品種安農(nóng)S-1[7]、株1S[8]是研究和應(yīng)用最廣泛的光溫敏雄性不育系，目前生產(chǎn)上應(yīng)用的“兩系不育系”大部分都是這三個(gè)品種的衍生系[9-10]。農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)資料顯示，截至2012年，兩系法雜交稻已累計(jì)種植3.2×107hm2(4.99億畝)[11]。

“兩系法”的核心是光溫敏細(xì)胞核雄性不育系（photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile line），其育性受到溫度和光照長度的影響，具體表現(xiàn)為短日照(或低溫)條件下，雄性正?？捎欢L日照(或高溫)條件下，雄性敗育[12]。光溫敏不育系受細(xì)胞核基因調(diào)控，隨著分子生物學(xué)與分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，截至2021年底，查詢到定位或克隆的光敏雄性不育基因（PGMS）有pms1[13]、pms2[13]、pms3(p/tms12-1)[14-16]、pms4[17]、RMS1[18]、OSWYOXIB[19]和CSA[20]。溫敏雄性不育基因（TGMS）在不同品種中差異很大，遺傳較為復(fù)雜，可能不是簡單的遺傳性狀調(diào)控[21]。溫敏雄性不育基因有tms1[22]、tms2(ORMDL)[23-24]、tms3[25]、tms4[26]、TGMS[27]、tms5(ptgms2-1(t))[28-29]、tms6[30]、tms6(t)-1[31]、tms6(t)-2[32]、tms8[33]、tms9[34]、tms9-1(PTC1)[35-36]、tms10[37]、tms18(osNP1)[38-39]、TMS[40]、Ms-h[41]、rtms-1[42]和OsUgp1[43]，以及光溫敏不育基因（PTGMS）pms1(t)[44]等。pms1和pms3（Os12g0545900）都是非編碼lncRNAs，但pms1為不完全顯性基因且在長日照條件下的PSMS株系中，phasiRNAs偏好性積累，從而造成光敏雄性不育[13]；pms3[14-16]為隱性基因，在長日照下特異的RNA分子轉(zhuǎn)錄量降低，結(jié)果造成正處于發(fā)育的花藥進(jìn)入程序化死亡（PCD）從而造成雄性不育。RMS1（Os04g0461000）和CSA(Os01g0274800)都編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子，李莉等[18]通過CRISPR/Cas9敲除RMS1后得到了具有光敏型雄性不育表型的突變體；而CSA是一個(gè)反光敏雄性不育基因，在雄性生殖發(fā)育過程中調(diào)控糖分配并且是種子早期萌發(fā)過程中的一種保護(hù)機(jī)制[20]。OSWYOXIB（Os02g0816900）編碼一個(gè)肌球蛋白，可能在花藥細(xì)胞的營養(yǎng)運(yùn)輸中起著重要的作用[19]。tms2（Os07g0452500）是一種血清類黏蛋白（ORM），植物ORMDL蛋白影響了鞘脂平衡，敲除后因?yàn)榛ǚ郯l(fā)育異常而影響育性[24]。tms5（Os02g0214300）編碼一個(gè)保守的RNA酶，在tms5突變體中，由于RNA酶功能缺失導(dǎo)致UbL40mRNA水平上升，mRNA過度積累導(dǎo)致花粉形成缺陷和雄性不育[45]。tms9-1（Os09g0449000）編碼一個(gè)PHD鋅指蛋白，該基因在衡農(nóng)S-1中存在一個(gè)T到C的置換，導(dǎo)致了一個(gè)氨基酸的變化從而造成雄性不育[35]。tms10（Os02g0283800）編碼一個(gè)SERK家族類受體蛋白激酶，表明激酶活性對于高溫下的絨氈層變性和雄性生育力至關(guān)重要[37]。tms18（Os10g0524500）是葡萄糖-甲醇-膽堿（GMC）氧化還原酶家族成員[38]。OsUgp1（Os09g0553200）編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)，該酶通過催化葡萄糖-1-磷酸和UTP形成UDP-葡萄糖和焦磷酸的可逆反應(yīng)造成雄性不育和育性恢復(fù)[43]。此外，tms4[26]和tms9[34]定位于水稻第2染色體，pms2[13]和tms6(t)-1[31]定位于第3染色體，pms4[17]定位于第4染色體，tms6[30]定位于第5染色體，tms3[25]和TMS[40]定位于第6染色體，pms1(t)[44]定位于第7染色體，tms1[22]定位于第8染色體，TGMS[27]和Ms-h[41]定位于第9染色體，tms6(t)-2[32]和rtms-1[42]定位于第10染色體，tms8[33]定位于第11染色體。

本研究團(tuán)隊(duì)通過60Co-γ輻射秈稻品種93-11，分離出了包括株高、分蘗數(shù)、株型、穗型、小穗結(jié)構(gòu)、育性、葉色、葉型、抽穗期、苯達(dá)松抗性等突變體[46]，并克隆了普通核雄性不育基因RMS2[47]、MS26-2245[46]、PTC1-2[48]和MSP1-1972[49]等。在93-11輻射誘變突變體庫后代3650號株系中篩選得到一個(gè)雄性不育突變體tms3650，對突變體進(jìn)行表型鑒定和基因定位研究，以期為進(jìn)一步研究該基因的功能和調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

秈稻93-11經(jīng)60Co-γ輻射誘變得到M0代，輻射后的種子種植于海南省臨高縣試驗(yàn)田，成熟后分單株收種，共獲得M1代材料約6500份。次年，種植M1代，每個(gè)家系種50個(gè)單株，在其中3650號株系中發(fā)現(xiàn)一種突變體表現(xiàn)為雄性不育，被命名為tms3650。所有水稻材料均按常規(guī)田間種植與管理，單株插，株行距16.3 cm×19.8 cm。93-11干種子由湖南省水稻研究所提供。

1.2 花粉育性鑒定

在海南臨高早稻季（2月中旬播種）、晚稻季（7月上旬播種）和湖南望城基地中稻季（5月中旬播種）栽培條件下，抽穗期取突變體tms3650家系不同植株的成熟花粉用1%碘-碘化鉀溶液（0.6%KI，0.3% I2，w/w）進(jìn)行染色分析。此外，可育植株和不育植株套袋自交，每株3個(gè)重復(fù)，并考種統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。將tms3650突變體的稻蔸在2015年、2016年、2017年冬季（11月移栽）種植于海南省陵水縣提蒙鎮(zhèn)水稻育種基地，稻蔸圍膜隔離種植，安排稻蔸在1～2月短日照低溫孕穗，對抽穗后的花粉粒進(jìn)行碘染分析（10倍物鏡，顯微鏡型號Leica DM2500）并統(tǒng)計(jì)收種后結(jié)實(shí)率。陵水轉(zhuǎn)育后的種子于海南臨高和湖南望城育種基地再次播種，抽穗期取花粉碘染分析。

1.3 突變體育性轉(zhuǎn)換鑒定

對陵水收獲的轉(zhuǎn)育種子進(jìn)行大田種植鑒定和實(shí)驗(yàn)室品種SSR真實(shí)性鑒定。在臨高早稻季、晚稻季和湖南望城中稻季各取93-11作對照，轉(zhuǎn)育的tms3650突變體做待測樣品，編號并單本插秧，在苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期觀察記錄突變體與對照樣品的差異。根據(jù)水稻品種鑒定DNA指紋方法標(biāo)準(zhǔn)（《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn): 水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程》，SSR標(biāo)記法，NY/T 1433-2014）合成24對SSR標(biāo)記（附表1），以93-11和轉(zhuǎn)育后tms3650突變體種子萌發(fā)的葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR真實(shí)性鑒定。

1.4 遺傳分析及定位群體的構(gòu)建

正常大田栽培條件下，以突變體tms3650為母本，分別以野生型秈稻93-11、明恢63和粳稻中花11為父本，配制雜交種，觀察F1、F2和F3的表型，并統(tǒng)計(jì)野生型可育花粉植株和突變體雄性不育植株的分離比。

1.5 DNA提取及基因定位

在齊穗期觀察群體表型，取穗子包頸、花藥偏白的水稻小穗和對應(yīng)分蘗的劍葉進(jìn)行保存，小穗進(jìn)行育性鑒定后，選不育株葉片采用傳統(tǒng)CTAB法[50]提DNA。根據(jù)Michelmore等[51]的BSA極端性狀混合池分析法（bulked segregant analysis）和RCA隱性群體分析法（recessive-class analysis）對tms3650進(jìn)行基因定位。在Gramene在線網(wǎng)站（http://www.gramene.org/）合成SSR引物用于群體定位，引物交由深圳華大基因科技有限公司合成。PCR使用Biomiga的2×PCR預(yù)混合液5 μL，1 μL引物（含各0.5 μL正反向引物），1 μL模板DNA，ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)槌Ｒ?guī)SSR程序。擴(kuò)增產(chǎn)物使用6%的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，0.1%AgNO3染色，甲醛和NaOH顯色拍照統(tǒng)計(jì)基因型。

利用301對均勻分布于12條染色體上的SSR標(biāo)記[52]篩選93-11與明恢63之間的多態(tài)性，得到64對具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記（附表2），多態(tài)性較低，表明明恢63與93-11在基因組序列上差異較小。收tms3650和明恢63雜交F1種子，F(xiàn)1使用篩選得到的多態(tài)性標(biāo)記驗(yàn)證真實(shí)性。種植F1得到F2，F(xiàn)2分離得到的61個(gè)不育株用作初定位群體，構(gòu)建F2分離群體的不育株的混合基因池，每個(gè)混合池隨機(jī)選20株不育株DNA樣本，利用64對多態(tài)性標(biāo)記對所述混合基因池進(jìn)行分析。用篩選得到緊密連鎖的標(biāo)記鑒定F2分離群體的可育株，選擇雜合基因型株系收種F2，種植F2種子得到F3分離群體，F(xiàn)3分離得到的883個(gè)不育株用作精細(xì)定位群體。根據(jù)初定位結(jié)果繼續(xù)發(fā)展緊密連鎖標(biāo)記的SSR標(biāo)記（附表3），連鎖標(biāo)記對F3群體進(jìn)行分子鑒定。

1.6 候選基因分析

從水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）和NCBI秈稻93-11基因組注釋數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CM012055.1?report=graph）查詢精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的ORF并分析基因功能，水稻表達(dá)數(shù)據(jù)庫（https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP/index.php）分析區(qū)間內(nèi)基因表達(dá)譜，預(yù)測候選基因。下載候選基因全長DNA序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)測序引物，合成的引物同時(shí)PCR擴(kuò)增野生型93-11和突變體tms3650的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接和比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型分析

在湖南和海南種植的野生型及突變體材料除生育期有5～10 d差異外其他農(nóng)藝性狀基本一致。野生型93-11和突變體tms3650在分蘗性狀（圖1-A）和穗型上（圖1-B）沒有明顯差異，但突變體抽穗期稍遲（比對照93-11晚約5 d）且包頸，穎殼和小花（圖1-C）沒有明顯差異，野生型93-11花藥（圖1-D）大且黃，但突變體tms3650的花藥（圖1-D）白綠且瘦小，花粉碘染結(jié)果顯示野生型93-11成熟花粉粒能被碘液染成藍(lán)黑色（圖1-E），而tms3650花粉粒不能染色（圖1-F），徹底敗育。

圖1 野生型93-11和突變體tms3650表型鑒定Fig. 1. Phenotypic comparison of wild type 93-11 (WT)and tms3650.

冬季移栽陵水南繁后，突變體tms3650花粉粒部分花粉能被碘液染成藍(lán)黑色，部分未被染色（圖1-G），經(jīng)查詢陵水縣2015、2016和2017年1～2 月平 均 溫 度 為17～24℃（https://tianqi.2345.com/wea_history/59954.htm），符合光溫敏雄性不育育性轉(zhuǎn)育溫度。選擇9個(gè)突變體株系進(jìn)行花粉育性恢復(fù)調(diào)查及結(jié)實(shí)率分析（表1），可育花粉和不育花粉數(shù)幾乎一致，結(jié)實(shí)率在30%左右（突變體單株有效分蘗5～6個(gè)，穗粒數(shù)150粒左右）。上述結(jié)果表明突變體花粉的育性在短日照低溫條件下得到恢復(fù)，但恢復(fù)率不高，還需要繼續(xù)尋找合適的臨界轉(zhuǎn)育溫度和光照條件。

2.2 突變體育性轉(zhuǎn)換真實(shí)性鑒定

轉(zhuǎn)育后的突變體tms3650種子在海南臨高和湖南望城基地大田種植鑒定，除了穗子包頸和生育期延遲（比對照93-11晚5 d左右），其他農(nóng)藝性狀和野生型93-11一致，突變體生長整齊一致，無雜株。突變體花粉經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)完全敗育。隨機(jī)取突變體tms3650不同單株的葉片混樣構(gòu)建4個(gè)DNA池，以野生型93-11的模板DNA為對照。根據(jù)24對國標(biāo)引物PAGE膠檢測結(jié)果（圖2），野生型和突變體帶型完全一致，表明所選位點(diǎn)沒有引入外源基因。由此得出結(jié)論，在陵水點(diǎn)收獲的突變體tms3650種子為真實(shí)轉(zhuǎn)育自交種，而不是串粉導(dǎo)致。

圖2 野生型93-11和突變體tms3650品種真實(shí)性鑒定Fig. 2. Authenticity identification of wild-type 93-11 and mutant tms3650.

2.3 突變體遺傳分析

突變體tms3650作為母本，野生型93-11，粳稻中花11，秈稻明恢63作為父本雜交發(fā)現(xiàn)F1結(jié)實(shí)正常，說明突變體雌性育性正常且該基因是一個(gè)隱性基因。統(tǒng)計(jì)F2分離群體中的野生型和突變體株數(shù)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型和突變體分離比符合3∶1（表2），表明tms3650的雄性不育性狀受一對單基因控制。上述結(jié)果表明tms3650突變體受一對隱性單基因控制。

表2 突變體tms3650的遺傳分析Table 2. Genetic analysis of mutant tms3650.

2.4 初定位和精細(xì)定位

BSA初定位結(jié)果表明第3染色體上的SSR標(biāo)記RM055和RM293與tms3650的突變表型存在連鎖關(guān)系（附圖1）。進(jìn)一步在SSR標(biāo)記RM055和RM293 附近繼續(xù)開發(fā)分子標(biāo)記得到RM15900、RM15915、RM15935和RM15947。利用上述連鎖標(biāo)記逐個(gè)分析明恢63和tms3650的F2群體中的不育株的基因型，得到交換單株分別為18、2、1、0、0和5個(gè)。因此將目標(biāo)基因初步定位于第3染色體長臂上SSR標(biāo)記RM15900和RM15947之間（圖3-A）。

在標(biāo)記RM15900和RM15947之間繼續(xù)篩選多態(tài)性標(biāo)記，得到RM15919、RM15921、RM15927、RM15931、RM15934和RM15937。通過分析緊密連鎖標(biāo)記在F3群體883個(gè)不育單株的基因型。得到tms3650與上述RM15900到RM15947標(biāo)記之間的交換單株分別為11、3、2、2、1、0、2、4、4、6個(gè)（圖3-B），tms3650與標(biāo)記RM15931共分離（交換單株基因型和表型列于附表4），最終定位在135.25 kb的RM15927-RM15934區(qū)間內(nèi)（圖3-C）。

圖3 tms3650突變體的精細(xì)定位Fig. 3. Fine mapping of tms3650 mutants.

2.5 候選基因預(yù)測

根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫查詢精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的ORF，在標(biāo)記RM15927到RM15934之間135.25 kb物理距離區(qū)間內(nèi)共查詢到24個(gè)預(yù)測基因（表3），與已克隆雄性不育基因進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)該候選區(qū)間內(nèi)沒有克隆過的光溫敏雄性不育基因（圖4）。水 稻 表 達(dá) 數(shù) 據(jù) 庫 發(fā) 現(xiàn)，該 區(qū) 間 內(nèi)LOC_Os03g53650和LOC_Os03g53790在花藥中特異表達(dá)，其他基因在花期也有表達(dá)。選擇候選基因HTH DNA結(jié)合蛋白LOC_Os03g53600，PHD finger家族蛋白LOC_Os03g53630，半胱氨酸合酶LOC_Os03g53650，含有短鏈脫氫酶/還原酶家族結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)LOC_Os03g53690，PHD鋅指家族蛋白LOC_Os03g53700，醛 糖1-差 向 異 構(gòu) 酶LOC_Os03g53710，SRPK4蛋白LOC_Os03g53720，RNA識別基序LOC_Os03g53770，周質(zhì)β-葡萄糖苷酶前體LOC_Os03g53790對這些基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增送測序，目前沒有發(fā)現(xiàn)造成的突變位點(diǎn)，正在繼續(xù)測序驗(yàn)證上述基因啟動子區(qū)及區(qū)間內(nèi)的其他候選基因。

圖4 第3染色體已克隆或定位的雄性不育基因Fig. 4. Male sterility genes cloned or mapped on rice chromosome 3.

表3 目標(biāo)區(qū)域預(yù)測基因Table 3. Predicted gene in target region.

2.6 緊密連鎖標(biāo)記在不同品種中的多態(tài)性驗(yàn)證

根據(jù)精細(xì)定位結(jié)果，我們得到了和光溫敏雄性不育基因TMS3650緊密連鎖的分子標(biāo)記RM15931。為了驗(yàn)證標(biāo)記在指示tms3650突變體光溫敏雄性不育表型上的特異性，我們分析了在多個(gè)品種中該標(biāo)記的多態(tài)性。這些品種包括兩系不育系GD-7S、隆科638S，三系保持系野香B、特B、博II B、H28B，恢復(fù)系93-11、明恢63、R51084，常規(guī)品種中花11。由圖可知（圖5），RM15931擴(kuò)增出了156 bp的條帶，其他品種擴(kuò)增出150 bp的多態(tài)性條帶，通過鑒定發(fā)現(xiàn)該連鎖標(biāo)記可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

圖5 連鎖標(biāo)記RM15931親本多態(tài)性鑒定Fig. 5. Identification of parental polymorphism of linked markers RM15931.

3 討論

雖然“兩系法”雜交水稻一般由隱性核雄性單基因調(diào)控，但目前已克隆的光溫敏雄性不育基因還是太少，很多遺傳機(jī)理還不是很清楚。林艷等[53]通過TALEN編輯日本晴和明恢86的pms3基因，發(fā)現(xiàn)突變體并不產(chǎn)生光溫敏雄性不育表型。王芳權(quán)等[54]發(fā)現(xiàn)pms3基因在培矮64S和粵光S中并不能獨(dú)立起作用，還需要與其他基因共同調(diào)控，pms3基因還受到其上游轉(zhuǎn)錄本AK111270產(chǎn)生的siRNA介導(dǎo)的甲基化調(diào)控[55]。Qi等[35]發(fā)現(xiàn)tms9-1與明恢63在第3外顯子上有一個(gè)T到C的差異導(dǎo)致氨基酸的改變導(dǎo)致光溫敏雄性不育，但Li等[36]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)編碼一個(gè)PHD鋅指蛋白基因PTC1，在第2個(gè)外顯子T的插入使翻譯提前終止導(dǎo)致其普通核雄性不育，推測突變的位置不同，造成育性影響不同。OsNP1[39]是一個(gè)無花粉型普通核雄性不育基因，但tms18與OsNP1在不同位點(diǎn)突變會引起不一致的性狀表型[38]。由此可見，部分基因的不同突變甚至能造成不一樣的表型。因此，挖掘、鑒定新的光溫敏雄性不育基因?qū)M(jìn)一步闡明光溫敏雄性不育的分子機(jī)制具有十分重要的意義。

本研究從93-11的輻射誘變體庫中獲得了一個(gè)雄性不育突變體tms3650。表型鑒定發(fā)現(xiàn)突變體花藥瘦小且白綠，花粉碘染完全敗育，抽穗期比93-11稍晚5 d左右，其他農(nóng)藝性狀正常。遺傳分析發(fā)現(xiàn)突變體受一個(gè)單隱性核基因控制，通過多年次在海南陵水冬季南繁（11月至次年4月）種植tms3650突變體稻蔸，發(fā)現(xiàn)在短日照（日照時(shí)間小于12 h）低溫（17～24℃）條件下部分花粉轉(zhuǎn)育并結(jié)實(shí)，收種繼續(xù)種植并通過大田鑒定和分子SSR真實(shí)性鑒定其為真實(shí)自交種，因此得出tms3650是一個(gè)光溫敏雄性不育突變體。通過將突變體和明恢63雜交得到F1，自交后代F2和F3分離群體用來定位，最終將基因定位于第3染色體長臂SSR標(biāo)記RM15927到RM15934之間物理距離135.25 kb區(qū)間范圍內(nèi)，且與標(biāo)記RM15931共分離。

通過基因組注釋數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)有24個(gè)預(yù)測基因，沒有已克隆的育性相關(guān)基因，已定位在第3染色體的光/溫敏雄性不育基因pms2[13]和tms6(t)-1[31]，以及定位在第3染色體長臂的普通核雄性不育基因EPAD1[56]、TIP3[57]、OsDEX1[58]和MEL1[59]同tms3650定位區(qū)間不在一個(gè)位點(diǎn)，說明TMS3650是一個(gè)新基因。目前已克隆的光溫敏雄性不育基因功能有非編碼RNA、MYB轉(zhuǎn)錄因子、肌球蛋白、血清類黏蛋白、PHD鋅指蛋白、葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因、SERK家族類受體蛋白激酶。通過對該區(qū)間的基因編碼區(qū)進(jìn)行測序暫時(shí)沒有找到候選基因，猜測該基因可能在候選基因的啟動子區(qū)發(fā)生變異或者是其他預(yù)測不同代謝路線功能的基因，需要繼續(xù)測序并構(gòu)建不同的群體對定位區(qū)間及候選基因加以驗(yàn)證。

本研究進(jìn)一步利用緊密連鎖標(biāo)記對育種中常用的保持系進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記RM15931在部分常用的保持系、恢復(fù)系和常規(guī)稻之間都存在多態(tài)性，可以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。但由于突變體在陵水南繁轉(zhuǎn)育后結(jié)實(shí)率較低，后續(xù)還需要繼續(xù)鑒定基因的臨界轉(zhuǎn)育溫度，并弄清楚該基因是光照敏感還是溫度敏感型雄性不育。本研究為該光溫敏雄性不育基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種及進(jìn)一步研究該基因的功能和調(diào)控機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

在線輔助性信息：附表1～4和附圖1請見《中國水稻科學(xué)》網(wǎng)站http://www.ricesci.cn。