陳濤 趙慶勇 朱鎮(zhèn) 趙凌 姚姝 周麗慧 趙春芳 張亞東* 王才林*

(1江蘇省農業(yè)科學院 糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質水稻工程技術研究中心/國家水稻改良中心 南京分中心，南京 210014；2揚州大學 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚州 225009; *通信聯(lián)系人, email: zhangyd@jaas.ac.cn; clwang@jaas.ac.cn)

我國是世界最大的稻米生產國，年種植面積約3000萬hm2，占全球水稻總種植面積的近20%，年產稻谷超過2.1億t，約占全球稻谷總產量的30%[1]。同時，水稻也是我國是第一大主糧作物，約占居民口糧消費總量60%[2]。稻米在為人們提供碳水化合物的同時，也是植物性蛋白質的重要來源。研究表明，稻米蛋白質含量約占糙米干質量的8%～10%，是僅次于淀粉的第二大類貯藏物質，其含量與稻米營養(yǎng)價值密切相關[3]。根據(jù)溶解特性的不同，稻米貯藏蛋白分為溶于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白、溶于稀鹽溶液的球蛋白、溶于水的清蛋白以及少量醇溶蛋白。其中，醇溶蛋白含量占20%～25%，貯存在致密的Ⅰ型蛋白體中，不能被人體消化，而由37～39 kD α酸性亞基和22～23 kD β堿性亞基組成，以Ⅱ型蛋白體形式存在的谷蛋白含量較高，約占種子貯藏蛋白的60%～75%，是稻米蛋白中可供人體吸收的主要成份[4]。因此，稻米營養(yǎng)價值的改善可以通過提高谷蛋白含量得以實現(xiàn)。

隨著我國城鄉(xiāng)居民生活方式和飲食結構的改變，腎臟病的發(fā)病率逐年升高，已成為威脅公共健康安全的重要疾病。據(jù)統(tǒng)計，我國慢性腎臟病人1.32億，患病率高達10.8%，其中住院患者88.8萬，占住院總人數(shù)的4.8%[5]。由于腎臟病患者常伴有腎機能不全、蛋白代謝紊亂等癥狀，要減輕腎臟負擔，除進行必要的藥物治療外，還必須在飲食中嚴格限制病人對可溶性蛋白的攝入。目前市場上可供腎臟病專用的低蛋白食品不僅種類稀少而且價格昂貴，這無疑增加了患者的經濟和精神負擔，降低了治療效果[6]。因此，為滿足腎臟病人對該類食品的特定需求，培育綜合性狀優(yōu)良的低谷蛋白水稻新品種已成為當前功能性水稻育種的一個重要方向。

低谷蛋白水稻的研究始于日本。Iida等[7-8]利用化學誘變劑乙烯亞胺處理水稻Nihonmasari的種子，篩選到低谷蛋白-高醇溶蛋白種質NM67，并在與原始親本雜交的F2代中得到農藝性狀較優(yōu)的育種新材料“LGC-1”。遺傳分析表明，LGC-1的低谷蛋白特性受單個顯性基因Lgc1控制，該基因位于水稻第2染色體標記XNpb243和G365之間[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在LGC-1中核苷酸序列相似性達99.8%的B亞族谷蛋白基因GluB4和GluB5之間存在一個3.5 kb的片段缺失，從而形成一個尾對尾的反向重復序列，該序列產生雙鏈RNA發(fā)夾結構，進而誘導RNA沉默，導致谷蛋白含量降低[10]。

在育種利用方面，日本育種家以LGC-1為親本先后選育出LGC-soft、Saikai 231、LGC-Katsu和LGC-Jun等品質優(yōu)良的低谷蛋白品種，并受到各大醫(yī)院及腎病患者的普遍歡迎[11-13]。我國開展相關品種選育的時間較晚，但發(fā)展迅速。2002年，南京農業(yè)大學水稻研究所利用低谷蛋白品種LGC-1與日本優(yōu)質粳稻越光雜交并以越光為輪回親本進行回交，結合分子標記輔助選擇育成了國內首個低谷蛋白新品種W3660[14]。此后，以LGC-1為直接或間接親本，與秈、粳稻主栽品種五山絲苗、武育粳3號、秀水128、圣稻735等進行雜交和選育，創(chuàng)制了一批優(yōu)質、高產的低谷蛋白新品系[15-18]。然而，這些材料在江蘇、上海等長江中下游適宜地區(qū)進行種植時，在食味品質上還難以滿足喜吃半糯香粳米人群的要求[19]。因此，迫切需要在育種中加強對功能性和食味品質方面的協(xié)同改良。

本研究以具有低直鏈淀粉含量基因Wxmp和香味基因fgr的優(yōu)良食味粳稻品種南粳46為母本，與含低谷蛋白基因Lgc1的日本粳稻品種LGC-1雜交、回交，利用與目標基因共分離的分子標記進行跟蹤檢測。在此基礎上，結合田間農藝、產量和品質性狀的選擇，選育具有優(yōu)良食味和香味特征的低谷蛋白高產粳稻新品系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料包括含Lgc1基因的低谷蛋白粳稻品種LGC-1，含低直鏈淀粉含量基因Wxmp和香味基因fgr的晚粳稻品種南粳46，南粳46和LGC-1雜交、回交后代以及具有Lgc1Lgc1 WxmpWxmpfgrfgr純合基因型的5個BC2F6新品系。所有材料在南京試驗基地按常規(guī)栽培方式進行田間管理。

1.2 DNA提取和分子標記檢測

水稻移栽后15 d，按單株剪取水稻葉片，用CTAB法提取基因組DNA[20]。低谷蛋白基因Lgc1檢測所用插入/缺失標記為InDel-Lgc1-1(正向序列5'-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3'，反向序列5'-CTGGGCTTTAACGGGACT-3')和InDel-Lgc1-2(正向序列5'-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3'，反向序列5'-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3')[21]；低直鏈淀粉含量基因Wxmp檢測所用標記序列為四引物擴增受阻突變體系PCR標記：正向外引物序列Wxmp-O-F為5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTG CAGGC-3', 反向外引物序列Wxmp-O-R為5'-GTA GATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'，正向內引物序列Wxmp-I-F為5'-GGGTGAGGTTTTTCCAT TGCTACAATCG-3'，反向內引物序列Wxmp-I-R為5'-GTCGATGAACACACGGTCGAC TCAAT-3'[22]；香味基因fgr檢測所用的插入/缺失標記為InDel-E2：正向引物序列5'-GGGAGGCGCTGAAGAGGA-3'，反向引物序列5'-GGGTAGTCACCACCCTACC TTG-3'[23]。20 μL PCR體系包括DNA（10 ng/μL）2.0 μL，引物（4 pmol/μL）2.0 μL，10×緩沖液（含MgCl2）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.4 μL，Taq（5 U/ μL）0.5 μL，ddH2O 13.1 μL。反應程序如下：95℃下預變性5 min；95℃下變性30 s，（Lgc1基因標記56℃，Wxmp基因標記65℃，fgr基因標記55℃）復性30 s，72℃下延伸1 min，循環(huán)35次；72℃下延伸7 min，10℃冷卻10 min。其中，Lgc1和Wxmp基因擴增產物加入DuRed核酸染料后在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，而fgr基因擴增產物在8.0%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和銀染顯色。

1.3 種子總蛋白提取、SDS-PAGE

種子總蛋白提取參照江紹玫等[24]的方法，略有改動。具體步驟：將單粒精米放入碾缽磨成極細的粉末，全部轉入1.5 mL 離心管。加入15 μL β-巰基乙醇浸潤20 min，再加入285 μL 65℃溫浴的蛋白抽提液（5 mol/L脲，4% SDS，20% 甘油，100 mmol/L Tris-HCl，pH=6.8），充分渦旋數(shù)秒鐘，室溫靜置過夜。電泳上樣前10 000 r/min下離心10 min，取10 μL上清進行SDS-PAGE電泳（分離膠15%，濃縮膠7.5 %），電泳后用考馬斯亮藍G-250染色。

1.4 稻米總蛋白和各組分含量測定

成熟稻谷放在通風處2個月后，經壟谷機（SY88-TH，韓國雙龍）、小型精米機（BLH-3120，臺州伯利恒）去殼出精，用旋風式磨粉機（CT193，F(xiàn)OSS，瑞典）研磨成米粉，過100目篩去除大顆粒，獲得用于測定的米粉?？偟鞍缀繙y定采用全自動凱氏定氮儀（Kjeltec 8400，F(xiàn)OSS，丹麥）測定米粉中的全氮含量，再乘以換算系數(shù)5.95。蛋白質組分的提取和測定參照相關方法進行，略有改動[25-26]。取精米粉0.5 g，按順序依次提取4種蛋白質，即清蛋白（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），球蛋白（1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），醇溶蛋白（體積分數(shù)為55%的正丙醇，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）和谷蛋白（質量分數(shù)為0.24% CuSO4·5H2O），1.68% KOH，0.5%酒石酸鉀鈉和體積分數(shù)為50%的異丙醇）。每次提取液用量為25 mL，室溫下振蕩2 h，其后于4000 ×g下離心10 min。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的測定采用考馬斯亮藍法，谷蛋白的測定采用雙縮脲法，分別計算出4種蛋白所占含量和比例，用凱氏定氮儀測定的總蛋白含量對各組分含量進行換算。每個樣品測定3次，取平均值。

1.5 農藝、產量和品質性狀測定

以親本LGC-1和南粳46作對照，對新品系進行比較試驗。每個品系（品種）重復3次，每重復小區(qū)栽種10行，每行28苗，株行距為13.2 cm×26.6 cm。各小區(qū)均分別記載播種期、抽穗期和收獲日期。成熟后，在每個小區(qū)的第5或第6行中間連續(xù)取樣10株，分別調查株高、單株穗數(shù)、單株實粒數(shù)、單株穎花數(shù)、每穗實粒數(shù)、每穗穎花數(shù)、結實率、千粒重和單株產量等性狀。同時，測定每個小區(qū)實收產量和稻谷含水量，并按粳稻14.5%的標準水分折算小區(qū)產量。

糙米率、精米率、整精米率、粒長、粒寬、堊白粒率、堊白度、糊化溫度、直鏈淀粉含量、膠稠度等性狀的測定參照優(yōu)質稻谷國家標準（GB/T 17891-1999），并利用米飯食味儀（STA-1A，日本佐竹）對食味值進行測定，每個樣品測定3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計分析

按照莫惠棟介紹的方法[27]，采用Excel 2016進行方差分析和多重比較，多重比較采用Duncan新復極差法。

2 結果與分析

2.1 分子標記輔助選擇和新品系選育

2009年夏，在南京以南粳46為母本與LGC-1進行雜交，同年冬季在海南種植F1，選擇真雜種作父本與南粳46進行回交，產生BC1F1種子。2010年夏，對21個BC1F1單株進行Lgc1、Wxmp和fgr基因進行檢測，其中2個單株同時具有Lgc1lgc1WxmpWxmpfgrfgr基因型，并以其作父本分別與南粳46進行回交，產生BC2F1（圖1）。2010年冬在海南，對2個BC2F1共25個單株進行檢測，其中11株為Lgc1lgc1WxmpWxmpfgrfgr基因型，按單株收獲種子。2011年夏，種植BC2F2株系，每個株系種植40株，在這些株系中選擇農藝性狀優(yōu)、豐產性好的85個單株進行檢測，篩選出19個Lgc1Lgc1WxmpWxmpfgrfgr基因型的單株。2012-2014年在南京分別種植BC2F3到BC2F5株系，并在農藝性狀、豐產性好的株系中選擇優(yōu)良單株，根據(jù)外觀品質性狀進行淘汰，最終在BC2F6中篩選出目標基因型明確、綜合性狀優(yōu)良、農藝性狀穩(wěn)定的5個新品系（圖2～3）。

圖1 BC1F1世代各單株Lgc1（A）、Wxmp（B）和fgr（C）基因型的電泳檢測Fig. 1. Electrophoresis detection of Lgc1(A), Wxmp (B) and fgr (C) genotype for B1C1 plants.

圖2 新品系Lgc1（A）、Wxmp（B）和fgr（C）基因型的電泳檢測Fig. 2. Electrophoresis detection of Lgc1(A), Wxmp (B) and fgr (C) genotype for new lines.

2.2 種子總蛋白的SDS-PAGE分析

從水稻種子總蛋白的電泳譜帶可以看出，與谷蛋白含量正常的品種南粳46相比，低谷蛋白品種LGC-1和5個新品系在成熟的谷蛋白α酸性亞基（37～39 kDa）和β堿性亞基（22～23 kDa）的條帶變弱、含量較低，而醇溶蛋白（13 kDa）的條帶增強、含量較高（圖4）。同時，以南粳46為母本與LGC-1雜交獲得的F1種子的蛋白條帶與LGC-1完全相同，表明由Lgc1基因控制的低谷蛋白性狀確實呈顯性遺傳，且不存在胚乳的劑量效應，這與前人的研究結論一致[9-10]。

圖4 低谷蛋白新品系種子總蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 4. SDS-PAGE analysis of total protein in rice seeds for new lines of low glutelin content.

2.3 新品系稻米總蛋白及各組分含量的分析

圖3 優(yōu)良食味、低谷蛋白香粳稻新品系的選育過程Fig. 3. Process of development of new low glutelin content japonica rice lines with good eating quality and fragrance.

對5個新品系及其親本的稻米總蛋白及各組分含量測定值的統(tǒng)計分析（表1）表明，L03、L07、L16、L19和L20的總蛋白含量為7.91%～8.15%，略高于南粳46，但品系間、親本間均無顯著性差異。新品系的谷蛋白含量為2.38～2.53%，醇溶蛋白的含量為4.30～4.47%，分別占總蛋白的比例為29.38～31.10%和54.11～55.37%，與LGC-1相近，而顯著低于和高于親本南粳46。在清蛋白、球蛋白的含量和比例上，新品系間和親本間均無顯著性差異。進一步對清蛋白、球蛋白、谷蛋白三種可吸收蛋白的總含量進行分析，5個新品系的可吸收蛋白含量為3.61%～3.74%，均顯著低于南粳46，而與LGC-1無明顯差異，符合低谷蛋白水稻%可吸收蛋白低于4%的指標要求。

表1 新品系與親本稻米總蛋白及各組分含量的比較Table 1. Comparison of total protein and its component contents in rice grains for new lines and parents.

2.4 新品系主要農藝、產量性狀的分析

分析新品系及其親本主要農藝和產量性狀的差異發(fā)現(xiàn)，除結實率外，10個相關性狀在不同品種（系）間的差異均達1%的顯著水平（表2）。5個新品系的生育期比LGC-1長20.4～40.0 d，其中L03、L07和L16比南粳46早6.7～20.0 d，而L19和L20與南粳46相近。株高為94.2～107.8 cm，介于親本LGC-1和南粳46之間。在產量性狀方面，與LGC-1多穗、彎小穗的田間表現(xiàn)不同，5個新品系的單株穗數(shù)明顯減少，每穗實粒數(shù)、每穗穎花數(shù)、單株實粒數(shù)、單株穎花數(shù)、千粒重、單株產量均顯著提高，表現(xiàn)出親本南粳46粗稈大穗、豐產性好的特征。與南粳46相比，L03和L07除單株穗數(shù)顯著增加，結實率、千粒重無明顯差異外，其他產量性狀均顯著降低；L16的每穗實粒數(shù)、每穗穎花數(shù)降低但穗數(shù)增加，因而單株實粒數(shù)、單株穎花數(shù)沒有減少，同時千粒重的增加反而使其單株產量顯著高于南粳46；L19和L20的產量性狀則與南粳46相似。實際測產與產量性狀的考種分析結果基本一致，其中L16的產量最高，L19和L20的產量與南粳46相近，L03和L07的產量雖低于南粳46，但均顯著高于低谷蛋白品種LGC-1（表2，圖5-A～F）。

2.5 新品系主要品質性狀的分析

進一步對其主要品質性狀進行方差分析，所測定的品質性狀在品種（系）間的差異均達5%或1%的顯著水平（表3）。多重比較的結果（表3）表明：親本和新品系的糙米率、精米率和整精米率等碾磨品質性狀較優(yōu)，其中L03、L16、L19的3項指標值與高值親本南粳46相近， L07、L20與低值親本LGC-1差異不顯著。外觀品質性狀中，新品系L16的粒長、粒寬均顯著高于其他品系和雙親，這可能是其千粒重較大的主要原因，其他品系與親本南粳46無明顯差異，但粒寬都顯著高于LGC-1；新品系的堊白粒率和堊白度均顯著高于親本LGC-1，個別品系如L03、L07、L16等的堊白粒率或堊白度高于高值親本南粳46，但總體較優(yōu)，都達到國標三級優(yōu)質稻谷的標準（圖5-G～L）。食味品質性狀中，由于新品系具有與優(yōu)良食味親本南粳46相同的WxmpWxmp純合基因型，其直鏈淀粉含量均在9.3%～9.8%范圍，顯著低于含WxbWxb純合基因型的親本LGC-1。同時，新品系直鏈淀粉含量的降低也導致其膠稠度升高。同時，食味值的測定結果也表明新品系的食味值均顯著高于低谷蛋白親本LGC-1，部分品系與南粳46接近。

圖5 低谷蛋白新品系和LGC-1的田間表現(xiàn)及稻米外觀Fig. 5. Field performance and appearance quality for new lines of low glutelin content and LGC-1.

3 討論

作為我國的主要糧食作物，水稻對保障國家糧食安全和促進國民經濟發(fā)展具有重要意義。長期以來，水稻改良的目標主要集中在高產、優(yōu)質、抗病蟲等重要農藝性狀，并育成了一批具有重大應用價值的優(yōu)良品種。近年來，隨著社會經濟的不斷發(fā)展和生活水平的持續(xù)提升，飲食健康逐漸引起人們的關注。因此，加快功能稻米的相關研究和產業(yè)化，才能滿足人們由“吃得飽”、“吃得安全”，向“吃得健康”轉變，從而推動健康中國戰(zhàn)略的深入實施。

功能稻米是一類區(qū)別于普通稻米的水稻功能性產品。它除具備能維持人體正常能量所需的基本營養(yǎng)成分外，同時其稻米皮層、胚和胚乳等含有某些對人體健康有益的生理活性物質或特殊成分較普通稻米高或低，通過食用可以平衡體內營養(yǎng)、預防疾病發(fā)生和促進疾病康復，且符合安全標準的一類稻米產品[28-29]。根據(jù)其功能性成分的類型，可分為功能性蛋白質型、活性多糖型、功能性油脂型、功能性維生素型、功能性黃酮類化合物型、必需微量元素型等[30]，其中低谷蛋白稻米屬于功能性蛋白質型。與普通稻米相比，其谷蛋白含量明顯降低，可吸收蛋白含量低于4.0%。臨床試驗表明，利用低谷蛋白大米對慢性腎臟病患者進行飲食輔助治療，能夠減少蛋白攝入量，明顯降低血清肌酐含量[31]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，它能明顯降低健康小鼠的尿蛋白水平，對腎臟具有一定的保護作用，且對小鼠的營養(yǎng)狀況沒有影響[32]。同時，通過在仿生大腸反應器中對健康人群的糞便微生物的發(fā)酵試驗也證實低谷蛋白大米對腸道菌群的結構和代謝均具有正向影響[33]。因此，作為腎臟病患者一種經濟、有效的食療輔助品，低谷蛋白大米具有廣闊的應用前景，而培育低谷蛋白新品種也成為功能性水稻育種的熱點。

傳統(tǒng)低谷蛋白品種的選育主要是根據(jù)種子總蛋白的SDS-PAGE電泳來推測其基因型并進行選擇。由于控制低谷蛋白性狀的Lgc1基因為顯性遺傳，要明確雜合或純合基因型就必須對同一單株的多個籽粒進行檢測，其操作過程繁瑣、工作量大。同時，在實際育種中還需考慮對其他重要基因和綜合性狀的選擇，僅通過傳統(tǒng)育種方法很難育成具有多個目標性狀基因的優(yōu)良品種。分子標記輔助選擇利用與目標性狀基因緊密連鎖的分子標記對基因型進行選擇，且不受環(huán)境和等位基因顯隱性、互作的影響，是實現(xiàn)水稻多基因聚合的一種重要手段，并在功能稻育種方面取得明顯成效。張光恒等[34]將轉葡萄糖焦磷酸酶（AGP）基因的水稻中超123的T5代純系與富含γ-氨基丁酸的水稻巨胚1號雜交，通過分子標記輔助選擇創(chuàng)建了高千粒重且具有降血壓作用的功能稻新品系；Morita等[35]利用開發(fā)的分子標記對低谷蛋白品種LGC-1與來自越光的α-球蛋白缺失突變體的雜交后代進行輔助選擇，創(chuàng)制出可吸收蛋白含量進一步降低的水稻材料；王萌等[36]以紅米正常胚品系上師大6號和白米巨胚品種上師大5號進行雜交、回交，并結合紅米基因Rc、Rd、巨胚基因gec和條紋葉枯病抗性基因qSTV11KAS的分子標記輔助育種，選育出兼具抗病性的紅米巨胚功能稻新品系上師大10號。本研究中，為培育符合江蘇、上海等長江中下游消費需求的優(yōu)良食味、低谷蛋白香粳稻品種，我們選擇被譽為“江蘇最好吃大米”的江蘇高產粳稻品種南粳46與日本低谷蛋白品種LGC-1進行配組，從而聚合關鍵的目標性狀基因。為提高選擇效率，在回交和自交的早期世代利用與低直鏈淀粉含量基因Wxmp、香味基因fgr和低谷蛋白基因Lgc1的功能性分子標記進行篩選，并結合常規(guī)育種的方法，選育出同時含有多個目標基因的粳稻新品系。與LGC-1相比，新品系的谷蛋白含量和可吸收蛋白含量相仿、食味品質得到顯著提升。此外，在分子標記輔助選擇時，我們也注重對其他重要性狀的協(xié)同改良。分析結果表明，這些新品系不僅農藝性狀良好，具有較高的增產潛力，而且其碾磨品質也得到明顯改善。同時，新品系的生育期比親本LGC-1長20.4～40.0 d，適宜在江蘇中粳中熟、遲熟中粳和晚粳稻區(qū)進行選擇性種植。

同時，研究中我們也發(fā)現(xiàn)雜交方式對提高品種選育的效率也非常重要。親本LGC-1和南粳46雖同為粳稻，但地理來源不同，雙親遺傳關系較遠，F(xiàn)2世代的農藝性狀會出現(xiàn)嚴重分離。若直接從該世代開始進行系譜法選擇，不僅基因型檢測的工作量大、成本高，而且很難篩選到農藝性狀理想的單株。因此，本研究中我們將豐產性好的品種南粳46作輪回親本回交兩次再進行自交選擇，既保證后代群體具有一定的遺傳多樣性和優(yōu)良的農藝性狀，而且也降低了田間種植和標記檢測數(shù)量，顯著提高了育種效率，這與目前利用日本品種LGC-1作親本選育低谷蛋白水稻品種（系）的多數(shù)育種家的思路基本一致[14-15,18]。

由此可見，作為一種快速、準確、有效的育種手段，分子標記輔助選擇目前仍不成熟、不完善，特別是在微效基因控制的數(shù)量性狀選擇上還不能完全替代常規(guī)育種的作用，兩者只有在實踐中緊密結合，才能高效、同步的改良產量、品質、抗性等綜合性狀，才能為水稻育種注入科技創(chuàng)新的活力。