陳彩鳳 陳 黎 張丹群

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院皮膚科，福建福州， 350001

銀屑病是一種慢性炎癥性復(fù)發(fā)性皮膚病，本病發(fā)病率高，全球發(fā)病率約2%～4%[1]。典型臨床表現(xiàn)為局限或泛發(fā)性鱗屑性紅斑或斑塊[1,2]。該病發(fā)病機(jī)制尚未闡明。此病反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，給患者帶來巨大的精神心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，極大影響了患者的生活質(zhì)量[1,3]。

C10orf99是近年采用免疫組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)并鑒定的新細(xì)胞因子，筆者前期通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C10orf99通過參與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥調(diào)控影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展[4]。

LCN2是lipocalin蛋白超家族的成員，是一種分泌的糖蛋白。多項(xiàng)研究顯示LCN2在銀屑病患者皮損及血液中表達(dá)量均明顯升高，并且參與了銀屑病中的炎癥調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖調(diào)控[5-7]。但關(guān)于其上游調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在檢測C10orf99下調(diào)對于銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中LCN2表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 HaCaT長期保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑 重組人 IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα及OSM均購自美國Peprotech公司；Trizol核酸抽提試劑購自Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量熒光底物購自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA細(xì)胞裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗人LCN2(YT7924)購自ImmunoWay公司；通用型SP試劑盒、DAB試劑盒、鼠抗人β-actin及實(shí)驗(yàn)中所用二抗均購自中杉金橋生物公司；慢病毒載體的構(gòu)建和包裝來自上海吉瑪生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HaCaT培養(yǎng) 采用含10% FBS的高糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)HaCaT，放置于37℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天更換1次培養(yǎng)基。以1∶5比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期HaCaT進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 銀屑病細(xì)胞模型的建立 選擇對數(shù)生長期的HaCaT，按5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種六孔板。待細(xì)胞生長至80%融合度時(shí)，更換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)。次日將培養(yǎng)基換成含10% FBS的高糖DMEM，并加入M5(IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα及OSM，終濃度為10 ng/mL)刺激細(xì)胞48 h。

1.3.3 銀屑病動物模型的建立 參照既往實(shí)驗(yàn)方法采用咪喹莫特乳膏構(gòu)建銀屑病動物小鼠模型[4]。

1.3.4 慢病毒的轉(zhuǎn)染 將處于生長期的HaCaT以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種六孔板。待細(xì)胞融合度為40%時(shí)，將培養(yǎng)基換成含有polybrene(終濃度為5 μg/mL)的無抗高糖DMEM培養(yǎng)基，加入100 μL已解凍的慢病毒顆粒(sh-C10orf99)。對照組加入等量的陰性對照慢病毒顆粒(sh-NC)。輕柔混勻孔中內(nèi)容物，放回CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染病毒48 h后，更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后，開始使用嘌呤霉素(5 μg/mL)篩選，共篩選14天。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)總共分為4組，分別為對照組(Control組)、M5模型組(M5組)、陰性對照組(sh-NC組，即干擾空載感染穩(wěn)篩細(xì)胞組)和實(shí)驗(yàn)組(sh-C10orf99，即干擾C10orf99感染穩(wěn)篩細(xì)胞組)。Control組即正常對照組；其余三組均予M5干預(yù)。

1.3.6 qRT-PCR 用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。具體引物序列見表1。進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用計(jì)算機(jī)分析Ct值。用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后用2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3.7 Western Blot 使用RIPA裂解各細(xì)胞組的蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA試劑盒測定蛋白濃度。樣品煮沸后開始進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和5%的牛奶室溫封閉。一抗4℃恒溫?fù)u床孵育過夜；次日，二抗室溫?fù)u床2 h，后使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。

表1 所用引物序列

1.3.8 免疫組化 石蠟標(biāo)本5 μm切片，常規(guī)脫蠟、水化；使用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)；血清封閉后37℃封閉10 min，一抗4℃過夜；二抗孵育后DAB顯色，后行復(fù)染、脫水，最后封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，組間數(shù)據(jù)比較采用T-test分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LCN2在銀屑病小鼠模型皮損中的表達(dá)情況 采用咪喹莫特乳膏構(gòu)建銀屑病的動物模型，獲取組織總RNA后，使用qRT-PCR檢測LCN2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：咪喹莫特模型組(Model組)小鼠皮損處LCN2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組(Control組)小鼠皮膚處的表達(dá)量(P<0.05)。見圖1。同時(shí)采用免疫組化法進(jìn)行蛋白水平的檢測，結(jié)果顯示LCN2低表達(dá)于正常小鼠皮膚組織中的表皮層，而其高表達(dá)于咪喹莫特銀屑病小鼠皮損中增厚的表皮棘層及下延的表皮突中。見圖2。

2.2 C10orf99慢病毒轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證 根據(jù)吉瑪公司提供的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，我們成功獲得了穩(wěn)定感染慢病毒的HaCaT株。為明確慢病毒的效果，我們收集了病毒轉(zhuǎn)染后的HaCaT，提取了細(xì)胞總RNA。qRT-PCR結(jié)果顯示：與sh-NC相比，C10orf99慢病毒感染的sh-C10orf99組HaCaT中C10orf99 mRNA的表達(dá)水平大幅度下降。見圖3。

2.3 LCN2在銀屑病細(xì)胞模型中的表達(dá)情況及C10orf99表達(dá)下調(diào)后HaCaT中LCN2的表達(dá)情況 采用M5刺激HaCaT細(xì)胞來構(gòu)建銀屑病細(xì)胞模型。結(jié)果示：與正常組相比，M5模型中LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達(dá)水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明LCN2在M5銀屑病細(xì)胞模型中表達(dá)量明顯增加。此外，當(dāng)我們使用慢病毒敲低HaCaT中C10orf99后，數(shù)據(jù)顯示，與sh-NC組相比，C10orf99敲低組中LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達(dá)水平明顯下降，表明C10orf99的敲低下調(diào)了銀屑病細(xì)胞模型中LCN2的表達(dá)。見圖4、5。

圖1 LCN2 mRNA在各組小鼠皮損組織中的表達(dá)情況(* P<0.05) 圖2 銀屑病小鼠(2a)與正常小鼠(2b)皮膚組織中LCN2的表達(dá)(SP)

圖3 qRT-PCR 法檢測各細(xì)胞組中C10orf99 mRNA的相對表達(dá)量(*P<0.05) 圖4 LCN2 mRNA在各細(xì)胞組中的表達(dá)情況(*P<0.05 vs Control; # P<0.05 vs sh-NC) 圖5 LCN2蛋白在各細(xì)胞組中的表達(dá)情況

3 討論

銀屑病是常見的慢性系統(tǒng)性炎癥性皮膚病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未闡明。目前銀屑病治療方法多樣，但是該病病情頑固、易反復(fù)，尚不能治愈，且患者常罹患代謝綜合征、心臟病等多種合并癥，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1，8，9]。因此，銀屑病是亟待解決的世界性健康難題之一，進(jìn)一步研究及探尋更有效安全的治療新策略或者新靶點(diǎn)是銀屑病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

近來多項(xiàng)研究顯示LCN2高表達(dá)于銀屑病、濕疹和損傷皮膚等多種炎性皮膚病和角化棘皮瘤、鱗癌等皮膚腫瘤中，提示其在抗炎、細(xì)胞增殖分化中扮演重要角色[5，6，10-12]。作為中性粒細(xì)胞趨化因子，LCN2通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的功能和放大TH17細(xì)胞功能參與銀屑病發(fā)病機(jī)制，IL-17也誘導(dǎo)LCN2的產(chǎn)生和分泌，形成炎癥循環(huán)進(jìn)一步放大炎癥網(wǎng)絡(luò)[7，13]。動物實(shí)驗(yàn)示中和LCN2后明顯改善銀屑病表皮的異常增生和炎癥情況[13]。但關(guān)于其具體上游調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

C10orf99是潛在新細(xì)胞因子，其異常表達(dá)于浸潤性導(dǎo)管癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌等多種腫瘤組織[14，15]。最新研究發(fā)現(xiàn)其是孤兒受體GRR15的天然配體，參與調(diào)節(jié)皮膚及胃腸道處淋巴細(xì)胞的募集[16，17]。另有研究發(fā)現(xiàn)C10orf99 mRNA在銀屑病皮損中表達(dá)增加[18]。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)C10orf99通過ERK1/2和NF-κB信號通路參與了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖調(diào)控[4]。動物實(shí)驗(yàn)提示C10orf99還通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與銀屑病發(fā)生發(fā)展，但具體有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究[4]。

本次研究我們發(fā)現(xiàn)LCN2高表達(dá)于銀屑病細(xì)胞模型中，并確認(rèn)了其在銀屑病動物模型中表達(dá)量是增加的，此結(jié)果與既往報(bào)道一致[7，13]。通過慢病毒轉(zhuǎn)染成功獲得了C10orf99低表達(dá)的HaCaT株，并發(fā)現(xiàn)C10orf99的下調(diào)抑制了炎癥微環(huán)境HaCaT中LCN2的表達(dá)，表明C10orf99很可能通過調(diào)控LCN2的表達(dá)來參與銀屑病炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，具體有待后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)C10orf99在銀屑病發(fā)生機(jī)制中扮演著重要角色，為探尋銀屑病潛在治療靶點(diǎn)提供了新的思路。