劉國(guó)星，杜見(jiàn)霞，劉秀紅，杜亞軍，但國(guó)梅，王 浩，董振松

（棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北棗陽(yáng) 441200）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心臟疾病的終末階段，其發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴(yán)重威脅人們的健康［1］?，F(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，但CHF 的療效依然欠佳。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在心力衰竭中發(fā)揮著重要作用［2］。Cao 等［3］報(bào)道可通過(guò)降低心肌細(xì)胞的自噬水平改善心臟功能。金絲桃苷是普遍存在于金絲桃科、藤黃科、葵科等果實(shí)中的一類黃酮醇苷類化合物，其結(jié)構(gòu)為槲皮素-3-半乳糖苷。金絲桃苷被證實(shí)具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗心律失常、神經(jīng)保護(hù)及心肌細(xì)胞保護(hù)等［4-6］。到目前為止，未見(jiàn)金絲桃苷對(duì)CHF 心肌細(xì)胞自噬功能方面相關(guān)報(bào)道。本研究以SD 大鼠為研究對(duì)象，探討金絲桃苷對(duì)心力衰竭大鼠心臟功能的影響，并分析其自噬方面作用機(jī)制，為治療慢性心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金絲桃苷購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；自噬檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma 公司；異丙腎上腺素、BCA試劑盒購(gòu)自碧云天公司；Beclin-1、p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）I、LC3-II、GAPDH 抗體購(gòu)自Abcam公司。電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad 公司；JEM-1400EX透射電鏡購(gòu)自日本電子株式會(huì)社；DG3022A酶標(biāo)儀購(gòu)自北京倍肯醫(yī)療器械有限公司；IE33 型超聲心動(dòng)儀購(gòu)自上海創(chuàng)訊醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性SD 大鼠21 只，年齡2～3 個(gè)月，體質(zhì)量為230～250 g，無(wú)特定病原體級(jí)，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為：SYXK（魯）20150011。大鼠于溫度為（25±2）℃、相對(duì)濕度為30%～60%，于光照12 h/12 h 明暗交替的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行正式試驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)過(guò)程均已獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合3R原則。

1.3 動(dòng)物分組、建模及給藥

21 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為兩組，即假手術(shù)組（6 只）、造模組（15 只）。參照文獻(xiàn)［7］采用腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)建立CHF 大鼠模型，即將大鼠麻醉后仰面固定于操作臺(tái)，剃去胸腹部毛發(fā)、消毒，逐層打開(kāi)腹腔分離腹主動(dòng)脈，置入6 號(hào)鈍器針，用4-0 絲線穿過(guò)該段腹主動(dòng)脈連同6 號(hào)鈍器針和腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎后迅速拔出鈍器針。縮窄腹主動(dòng)脈至原來(lái)直徑的60%～70%，縫合，行常規(guī)抗感染治療。用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)大鼠造模成功后（造模死亡3 只大鼠）再隨機(jī)分為2 組：模型組（0.9%氯化鈉溶液2 mL/kg）和治療組。治療組大鼠建模后，每日腹腔注射給藥1 次［金絲桃苷30 mg/（kg·次）］，連續(xù)給藥4 周。假手術(shù)組和模型組以0.9%氯化鈉溶液代替。

1.4 采用超聲心動(dòng)圖檢查大鼠心肌功能

按照實(shí)驗(yàn)分組，各組大鼠于建模后4、8及12周行超聲心動(dòng)圖檢查，記錄心動(dòng)圖指標(biāo)：左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection farction，LVEF）、左心室舒張末期室間隔厚度（interventricular septal diastole，IVSd）、左心室收縮末期室間隔厚度（inter?ventricular septal systole，IVSs）、左心室縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒張末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall diastole，LVPWd）及收縮末期左心室后壁厚度（left ventricu?lar posterior wall systole，LVPWs）。具體操作：檢查前稱體質(zhì)量，將大鼠麻醉后固定于解剖板上，用超聲心動(dòng)儀探測(cè)心臟結(jié)構(gòu)及腹主動(dòng)脈縮窄情況。

1.5 采用醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變

各組大鼠于建模后12 周處死大鼠，取左心室組織1 mm×1 mm×1 mm 大小浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered sa?line，PBS）漂洗后，行醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色，于透射電鏡觀察心肌組織形態(tài)學(xué)的改變。

1.6 采用Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取凍存大鼠心肌組織100 mg，用預(yù)冷的組織裂解液提取蛋白。取適量蛋白樣品上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后，應(yīng)用電印跡轉(zhuǎn)移的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。加入一抗Beclin-1、p62、LC3I、LC3-II 4℃過(guò)夜，用TBST 緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入二抗室溫孵育1 h，DAB 顯色，采用Image J 分析軟件測(cè)定條帶吸光度（absor?bance，A）值，以GAPDH 表達(dá)作對(duì)照。

1.7 心肌細(xì)胞損傷模型的建立、分組及給藥

按文獻(xiàn)［8］方法提取原代心肌細(xì)胞，采用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）建立心肌細(xì)胞損傷模型，即從SD 乳鼠中取心肌組織，用差速貼壁方法分離原代心肌細(xì)胞，種于24 孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，分為4 組：對(duì)照組、ISO 模型組、金絲桃苷組、自噬抑制組。ISO 模型組、金絲桃苷組、自噬抑制組細(xì)胞分別用1 μmol/L ISO 刺激30 min 后，金絲桃苷組加入金絲桃苷（1 μmol/L），自噬抑制組加金絲桃苷（1 μmol/L）和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（5 μmol/L），收集處理48 h后細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。

1.8 免疫熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬情況

取細(xì)胞，加氯喹（10 μmol/L）培養(yǎng)6 h，加mito?tracker 溶液（250 nmol/L）避光孵育3 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，用4%多聚甲醛避光固定30 min，PBS 洗滌，封閉液處理。加一抗LC3 4℃，避光孵育過(guò)夜，加Cy3 二抗避光孵育2 h，PBS洗滌后裝片，聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并拍照。采用Image J進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算單個(gè)細(xì)胞平均自噬體數(shù)（自噬體顯黃色熒光）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)的結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組和治療組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查指標(biāo)LVEF、LVFS 降低，IVSs、LVPWs、IVSd 及LVPWd 明顯升高，且建模后8 周，模型組與假手術(shù)組相比或者治療組與假手術(shù)組相比，超聲心動(dòng)圖檢查各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。建模后12 周，與模型組相比較，治療組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)LVEF、LVFS 明顯升高（P＜0.05），IVSd、LVPWs、IVSs 和LVPWd 明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查指標(biāo)對(duì)比 ［n=6，±s］

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查指標(biāo)對(duì)比 ［n=6，±s］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，1）*P＜0.05

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變情況

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、規(guī)則，形態(tài)正常；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞內(nèi)有大量自噬空泡聚集，自噬體數(shù)目較多；治療組大鼠心肌病理學(xué)改變較模型組大鼠有明顯改善，自噬體數(shù)目減少，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯空泡，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較

2.3 各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

假手術(shù)組大鼠心肌組織中LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平較低，p62 蛋白表達(dá)水平較高。造模后，模型組大鼠心肌組織中LC3II/LC3I比例、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；給藥后，治療組大鼠心肌組織中LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），p62 蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)比較

表2 大鼠心肌組織中Beclin-1、p62 及LC3II/LC3I蛋白相對(duì)表達(dá)比較 ［n=6，±s］

表2 大鼠心肌組織中Beclin-1、p62 及LC3II/LC3I蛋白相對(duì)表達(dá)比較 ［n=6，±s］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，1）*P＜0.05

2.4 各組心肌細(xì)胞自噬水平比較

對(duì)照組、ISO 模型組、金絲桃苷組及自噬抑制組細(xì)胞中自噬體數(shù)分別為（4.3± 2.02）個(gè)、（39.8 ±6.03）個(gè)、（15.3 ± 6.83）個(gè)及（4.79 ± 2.41）個(gè)。與對(duì)照組相比，ISO 模型組心肌細(xì)胞自噬體數(shù)顯著增加（P＜0.05）。與ISO 模型組比較，金絲桃苷組及自噬抑制組自噬體數(shù)顯著下降（P＜0.05）；自噬抑制組下降更明顯，見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬水平比較

3 討論

自噬現(xiàn)象廣泛存在于各種生物體的各類細(xì)胞中，通過(guò)降解異常蛋白質(zhì)及受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。但過(guò)度的自噬會(huì)引起細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)疾病［9］。近年報(bào)道，心肌自噬功能紊亂在CHF 和心肌重構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用［10］。王晶晶等［8］報(bào)道千層紙素A 可通過(guò)影響心肌細(xì)胞的自噬來(lái)改善ISO 所誘導(dǎo)的大鼠CHF。

建模后4 周，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠IVSs、LVPWs、IVSd 及LVPWd 指標(biāo)明顯升高（P＜0.05），兩組LVEF、LVFS 指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；建模后8 周，模型組與假手術(shù)組相比，超聲心動(dòng)圖檢查各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明大鼠持續(xù)性心肌肥厚，對(duì)心功能產(chǎn)生了影響；醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色顯示模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞內(nèi)有大量自噬空泡聚集，自噬體數(shù)目較多。這提示，成功構(gòu)建了CHF 大鼠模型。經(jīng)金絲桃苷治療后，治療組大鼠LVEF、LVFS 升高（P＜0.05），IVSd、IVSs、LVPWs 和LVPWd 明顯降低（P＜0.05）；大鼠心肌病理學(xué)改變較模型組大鼠有明顯改善。這提示金絲桃苷可逆轉(zhuǎn)心室肥厚，改善大鼠心臟功能。

LC3 是細(xì)胞自噬的標(biāo)志蛋白，定位于自噬小體膜上，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)大量表達(dá)為L(zhǎng)C3Ⅱ，其表達(dá)水平常用來(lái)評(píng)估細(xì)胞自噬水平［11］。Weng 等報(bào)道［12］，大鼠在行腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)后，LC3-Ⅱ、Beclin1及自噬相關(guān)基因5 等自噬標(biāo)志物的表達(dá)顯著增加。p62 蛋白是自噬的底物之一，是自噬性降解的重要指標(biāo)［13］。Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），p62 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。說(shuō)明模型組大鼠心肌細(xì)胞自噬功能紊亂，細(xì)胞內(nèi)存在過(guò)度自噬現(xiàn)象，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量降低，造成心室壁變薄，影響心臟功能。這與醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色顯示：模型組大鼠自噬體數(shù)目較多的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷處理后可顯著提高p62 蛋白表達(dá)水平，降低LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平。提示金絲桃苷可通過(guò)抑制慢性心力衰竭模型大鼠心肌細(xì)胞自噬，減輕心力衰竭。

為了進(jìn)一步證實(shí)金絲桃苷抑制心肌細(xì)胞自噬情況，采用新生大鼠心肌細(xì)胞體外建立心肌細(xì)胞損傷模型。免疫熒光染色顯示，與正常組相比，ISO 模型組心肌細(xì)胞的自噬水平顯著增加，金絲桃苷處理后細(xì)胞自噬水平降低；加入金絲桃苷和自噬抑制劑3-MA 后，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞自噬水平。以上結(jié)果提示金絲桃苷可體外抑制心肌細(xì)胞發(fā)生自噬。

金絲桃苷有多種生物學(xué)活性，郭曉等［14］報(bào)道金絲桃苷對(duì)心力衰竭大鼠肝纖維化有抑制作用。楊永康等［15］報(bào)道金絲桃苷可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬減輕心肌梗死小鼠心臟及胸主動(dòng)脈的損傷。劉不悔等［16］報(bào)道金絲桃苷調(diào)控AMPK-ULK1 介導(dǎo)自噬，可改善D-半乳糖誘導(dǎo)腎臟衰老與損傷的作用。金絲桃苷抑制心肌細(xì)胞自噬的信號(hào)通路尚不清楚。Harder等［17］報(bào)道心肌細(xì)胞自噬與AKT1-RPS6KB1 信號(hào)通過(guò)相關(guān)。Jun 等［18］報(bào)道雷帕霉素通過(guò)抑制MEK/ERK 信號(hào)通路影響LC3-II，Beclin-1、Mcl-1 和p62的表達(dá)。Xiao 等［19］報(bào)道葫蘆素B 能通過(guò)激活A(yù)ktmTOR-FoxO3a 信號(hào)通路激活自噬。下一步我們將對(duì)金絲桃苷抑制心肌細(xì)胞自噬的信號(hào)通路進(jìn)行深入研究。

綜上所述，金絲桃苷可通過(guò)抑制慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞自噬，改善心臟的結(jié)構(gòu)及其功能，發(fā)揮對(duì)心力衰竭的治療作用。但其抑制心肌細(xì)胞自噬的信號(hào)通路尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。