汪姣，包良，杜吉雅，張菱芳，王海生

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

肝癌是常見的惡性腫瘤，是發(fā)病率和病死率最高的5種癌癥之一［1］。肝癌治療方法多樣，目前臨床以手術(shù)治療、化療、放療和靶向治療等療法為主［2］。因肝癌早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)多為中晚期，不再適合手術(shù)治療，晚期肝癌患者的治療方法有限，且復(fù)發(fā)率高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移。中醫(yī)藥療法在治療肝癌的過程中有預(yù)防復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等優(yōu)點(diǎn)［3］。

斑蝥素（cantharidin）是傳統(tǒng)中藥斑蝥的有效提取成分，研究表明其對(duì)胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用［4］。斑蝥素可通過阻滯肝癌細(xì)胞周期使其停滯在G2/M 期，有效抑制其增殖，并促進(jìn)凋亡，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)［5］；還可通過下調(diào)P－糖蛋白表達(dá)情況，逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/ADM 的多藥耐藥性［6］。目前，針對(duì)斑蝥素治療肝癌的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但主要以單靶點(diǎn)、單通路的作用機(jī)制為主，對(duì)其潛在的機(jī)制尚未進(jìn)行系統(tǒng)的研究。因此，筆者運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步對(duì)斑蝥素治療肝癌的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞箱中培養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)藥物、主要試劑及儀器

斑蝥素（美國(guó)Sigma公司，25 mg/瓶，批號(hào)：C7632），溶于DMSO 溶液中，配制成50 mmol/L 的母液，在?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)：8121174、2117119）；CCK－8（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MA0218－5－May－15E）；RIPA 裂解液（上海尚寶生物科技有限公司，批號(hào)：1092891）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶有限公司，批號(hào)：67－68－5）；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本Takara 生物公司，批號(hào)：PK0542、AKG0730A、AKE1154A）；Akt、PT3K（美國(guó)Affinity 公司，批號(hào)：AF6214、AF6261）；ECL 顯色液（美國(guó)伯樂公司，批號(hào)：102031721）；BCA 蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：VL316399）；Matrigel 膠（上海碧云天有限公司，批號(hào)：120420210222）。

多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)thermo公司）；PCR 儀（美國(guó)羅氏公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥素靶點(diǎn)的篩選

通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取斑蝥素的2D 結(jié)構(gòu)和SMILES 表達(dá)式，運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//old.tcmsp－e.com/tcmsp.php）和SwissTargetPrediction（https：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)，將Organism 設(shè)置為Homo Sapiens（人類），入選預(yù)測(cè)概率選擇大于0，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的靶點(diǎn)合并去重，得到斑蝥素的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2.2 肝癌靶點(diǎn)的獲取

以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）中獲取肝癌的潛在靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切，因此，以Score值為條件，將Score值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)選擇為肝癌的潛在靶點(diǎn)。合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的交集靶點(diǎn)，刪除重復(fù)，得到疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。利 用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對(duì)藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，得到“斑蝥素－肝癌”共同靶點(diǎn)31個(gè)。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心蛋白的篩選

運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入31個(gè)共同靶基因，將物種設(shè)置為Homo Sapiens，選擇交互作用大于0.4，去除游離節(jié)點(diǎn)，下載“tsv”格式的數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將同時(shí)滿足Degree、Betweenness 和Closeness 三項(xiàng)數(shù)據(jù)，并在平均值之上的靶基因選為核心靶點(diǎn)。

1.2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.abcc.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。將得到的交集靶點(diǎn)基因上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，并以P<0.05為篩選條件，將結(jié)果繪制成氣泡圖。

1.2.5 分子對(duì)接

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載斑蝥素mol2結(jié)構(gòu)，從蛋白數(shù)據(jù)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）中選擇下載核心靶點(diǎn)度值前6 的蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)的pdb 格式文件，并要求所選擇的蛋白盡量滿足以下條件［7］：①選擇物種為人；②蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中必須有1 個(gè)或多個(gè)小分子配體；③分辨率高；④pH 值接近人體正常生理范圍。利用AutoDock 4.2.6 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并通過Pymol 2.4.0軟件將對(duì)接結(jié)果可視化。

1.2.6 CCK檢測(cè)HepG2增殖

HepG2細(xì)胞以濃度1×105/mL均勻接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0、2.5、5、10、20 μmol/L的斑蝥素，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK－8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的光密度值（optical density，OD）。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real－time PCR）檢測(cè)mRNA的水平

按照Trizol 試劑（Invitrogen）說明書提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞內(nèi)總RNA，采用Nanodrop ND－1000 測(cè)定RNA 的濃度和純度，使用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）對(duì)1 μg 的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以cDNA 為模板，以10 μL 的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，PCR 反應(yīng)：95 ℃變性5 s，60 ℃延伸45 s，72 ℃退火10 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。引物序列見表1，以GAPDH 作為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果以2－ΔΔCt表示mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 核心靶蛋白引物序列表

1.2.8 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞接種至6 孔培養(yǎng)板中，用5 μmol/L 斑蝥素分別刺激細(xì)胞0、3、5、10、15 min，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞。12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，按照BCA 試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度。按每15 μL 蛋白樣品加入5 μL 蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min 后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品、半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗（1∶100 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每 次10 min。ECL 顯色液以1∶1 體積比混合滴在PVDF 膜上，使用凝膠成像拍照，利用Image J 軟件定量目標(biāo)條帶的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)的篩選

從TCMSP 和Swiss Target Prediction 中共獲得斑蝥素的靶點(diǎn)53個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到32個(gè)靶點(diǎn)。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇Relevance Score值大于中位數(shù)的為肝癌的靶點(diǎn)。從TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取1 468 個(gè)，GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得8 408 個(gè)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的靶點(diǎn)合并、去重后共得到8 408個(gè)肝癌的靶點(diǎn)，運(yùn)用Venny 2.1 平臺(tái)取交集后得到31 個(gè)共同靶點(diǎn)，分別是PPP2R2A、ADORA2B、ABCB1、POLB、CASP3、PTPN1、HSD11B1、BIRC5、PTGES、OPRK1、PTGS2、FGFR4、GABRA1、STAR、OPRM1、PRKCA、ELANE、UGT2B7、PREP、BCL2、PPP5C、CDC25A、PRKCD、VDR、PPP1CA、HMGCR、CAMK4T、P53、PTEN、PPP1CC和BAX。

2.2 斑蝥素與肝癌PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

上傳得到的交集靶基因至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，然后下載數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1，其中包含26 個(gè)節(jié)點(diǎn)和61 條連線，節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，依據(jù)度值（Degree）設(shè)定，顏色由淺到深代表度值由小到大。對(duì)網(wǎng)連線則代表靶點(diǎn)之間的相互作用。節(jié)點(diǎn)顏色和大小絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治龅玫蕉戎?、介度、緊密度的中位數(shù)分別為4、0.004 9、0.458 8，將同時(shí)滿足大于度值、介度、緊密度3個(gè)參數(shù)中位數(shù)的靶點(diǎn)列為核心靶點(diǎn)，參數(shù)見表2。由此推斷TP53、PTEN、CASP3等核心靶點(diǎn)在斑蝥素治療肝癌的過程中起著重要作用。

圖1 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 核心靶點(diǎn)及相關(guān)參數(shù)

2.3 GO分類富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析（P<0.05），以P值為篩選條件，選擇排名前十條繪制成氣泡圖，見圖2和圖3。GO 分類富集分析顯示，斑蝥素在治療肝癌的過程中參與了87 條生物過程（BP）（圖2a），主要包括蛋白質(zhì)去磷酸化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的調(diào)控等；涉及21 條分子功能（圖2b），主要為蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、蛋白磷酸酶活性等。GO 分類富集分析得出16 條細(xì)胞組分（圖2c），主要包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞液、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜、蛋白復(fù)合體等。

圖2 斑蝥素治療肝癌交集靶點(diǎn)的GO分析圖

KEGG 富集31 條信號(hào)通路，依據(jù)P值大小排名前二十的結(jié)果見圖3，主要涉及乙型肝炎通路、鞘脂類信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.4 斑蝥素治療肝癌的分子對(duì)接

將核心靶點(diǎn)度值（Degree）前6 的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)一步驗(yàn)證斑蝥素和肝癌的結(jié)合活性。結(jié)合自由能（Binding energy）可以評(píng)估受體和配體之間的親和性，一般認(rèn)為結(jié)合能<0 kJ/mol 表明配體分子和受體蛋白能夠自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能

圖4 斑蝥素治療肝癌的分子對(duì)接圖

表3 斑蝥素治療肝癌關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能

2.5 斑蝥素抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖

采用CCK 法檢測(cè)不同濃度的斑蝥素作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h后對(duì)其增殖的影響。結(jié)果與空白對(duì)照組（0 μmol/L）相比，斑蝥素能顯著抑制人肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間和劑量依賴性。見圖5。

2.6 斑蝥素影響HepG2相關(guān)基因的表達(dá)

采用Real－time PCR 法檢測(cè)斑蝥素作用于HepG2細(xì)胞后核心靶點(diǎn)mRNA 的表達(dá)情況。結(jié)果與對(duì)照組相比，斑蝥素干預(yù)組（5 μmol/L）中ABCB1（2.46 ±0.64）（P=0.017 3 <0.05）、PTEN（1.30 ± 0.13）（P=0.032 5 <0.05）、PTGS2（1.42 ± 0.07）（P=0.022 3 <0.05）和TP53（1.43 ± 0.01）（P=0.000 0 <0.01）的mRNA 表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CASP3（1.04 ± 0.12）（P=0.43）和PRKCD（1.11 ± 0.08）（P=0.58）的mRNA 表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明斑蝥素能夠上調(diào)ABCB1、PTEN、PTGS2 和TP53 的表達(dá)。見圖5。

圖5 斑蝥素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及核心靶蛋白mRNA表達(dá)的影響

2.7 斑蝥素對(duì)HepG2細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

5 μmol/L 斑 蝥 素 作 用 于HepG2 細(xì) 胞3、5、10、15 min 后，與空白對(duì)照組（0 min）相比，5 μmol/L 斑蝥素組的PI3K、Akt 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），說明斑蝥素對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路具有抑制作用。見圖6。

圖6 斑蝥素對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響

3 討論

大量研究證明，斑蝥素對(duì)多種癌細(xì)胞具有抗腫瘤的活性，但其作用機(jī)制復(fù)雜，以往的研究多以單靶點(diǎn)、單通路為主。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，從分子角度全面分析了斑蝥素治療肝癌的潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示，斑蝥素可通過TP53、PTEN、PTGS2及ABCB1等多個(gè)核心靶點(diǎn)發(fā)揮作用。TP53（細(xì)胞腫瘤抗原p53）是一種重要的腫瘤抑制因子，可通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯等多種細(xì)胞反應(yīng)防止癌癥的發(fā)生和發(fā)展［9］，部分肝癌的發(fā)生與p53基因的缺陷或突變密切相關(guān)［10］。TIAN 等［11］研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可通過上調(diào)TP53 抑制癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡。PTEN基因是一種具有雙特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致腫瘤血管生成增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［12］。PTGS2又稱環(huán)氧合酶－2（COX－2），在多種癌細(xì)胞中表達(dá)增加，研究表明COX－2 抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞有良好的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡功效［13］。而ABCB1在肝癌中高表達(dá)與肝癌的高耐藥性相關(guān)［14］。

GO分類富集分析結(jié)果顯示，斑蝥素發(fā)揮的肝癌治療作用與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期密切相關(guān)，早期的研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可通過下調(diào)β－catenin 和細(xì)胞周期蛋白（cyclin）的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，抑制肝癌細(xì)胞增殖和自我更新［5］，這也與本文的分析結(jié)果相一致。

KEGG 富集結(jié)果表明，共同靶點(diǎn)主要富集在PI3K/Akt、乙型肝炎通路、鞘脂類通路等。PI3K/Akt 在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝過程中發(fā)揮著重要作用，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展轉(zhuǎn)移和耐藥等方面密切相關(guān)［15］。有研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素通過下調(diào)EphB4 表達(dá)，調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 和PI3K/Akt通路抑制肝癌［16］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的科學(xué)性，本研究以HepG2 細(xì)胞為模型細(xì)胞，對(duì)預(yù)測(cè)的主要靶點(diǎn)和通路進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑蝥素能夠上調(diào)TP53、ABCB1、PTEN 和PTGS2 的mRNA 表達(dá)，下調(diào)PI3K/Akt 通路中PI3K、Akt 蛋白的表達(dá)，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了斑蝥素抗肝癌的潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并用分子對(duì)接技術(shù)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，斑蝥素抗肝癌具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，主要通過上調(diào)TP53、PTEN、ABCB1和PTGS2 等靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活以及HepG2細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)抗肝癌的作用。