張振興，趙孝慈，2，胡 騎，薛曉巖，3，楊欽鴻，3，宋建領(lǐng)

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部跨境動物疫病防控重點實驗室（部省共建），云南昆明 650224；2.永平縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南永平 672600；3.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224）

2022 年10 月，云南省某雞場大量雞只出現(xiàn)以飲食量減少、糞便稀薄、呼吸困難等為主要癥狀的疾病。剖檢發(fā)現(xiàn)，病雞呼吸道內(nèi)有大量黏液，腺胃黏膜水腫且腺胃有不規(guī)則出血斑，肺臟有炎癥并伴有出血，氣囊有纖維素性滲出物。初步確定雞群發(fā)生了呼吸系統(tǒng)傳染病。為進(jìn)一步確診病因，本研究采集患病雞組織樣品，對新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、鼻氣管鳥桿菌（Omithobacterium rhinotracheale，ORT）等易引起呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)病原進(jìn)行PCR 檢測[1-2]，以確定引起該雞場發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病的病原。

1 材料

1.1 病料

病料來源于云南省出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疫病的某雞養(yǎng)殖場。隨機挑選5 只發(fā)病癥狀明顯的病雞，采集其肺臟、脾臟、淋巴、喉氣管等組織樣品，冷藏送實驗室檢測。

1.2 主要試劑及陽性血清

RNA/DNA 核酸提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒、PCR 試劑盒、DL 2 000 Marker 等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；ORT 菌株，由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室分離鑒定保存；NDV、AIV 血凝抑制抗原，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；IBV、ILTV 弱毒疫苗，購自云南雄云生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺（型號LA2-4A1），購自ESCO公司；PCR 儀（型號9700），購自美國ABI 公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號2000），購自美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 臨床檢查

詢問患病雞場雞群信息，觀察病雞臨床表現(xiàn)；無菌條件下解剖病雞，觀察組織樣品病理變化[3]。

2.2 病料處理

將每只病雞的肺臟、脾臟、淋巴、喉氣管等組織樣品剪碎，混合為1 份樣品。5 份病雞樣品分別標(biāo)記為YNKM-1～5。把5 份樣品按照1:10 的體積比加入生理鹽水充分研磨，將研磨后的混合物反復(fù)凍融3 次，3 000 r/min 離心10 min，取上清液提取核酸備用[4]。

2.3 RNA/DNA 提取

按照RNA/DNA 核酸提取試劑盒說明書，分別提取組織上清液的RNA/DNA。

2.4 引物合成

根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的NDV、IBV、ITLV、AIV、ORT 基因序列[4-5]，分別設(shè)計合成引物（表1）。

表1 引物序列信息

2.5 病原核酸檢測及測序

采用RT-PCR 或PCR 方法[4-5]分別檢測NDV、AIV、IBV、ILTV、ORT 核酸。RT-PCR 擴增體系（總體積25.0 μL）：RNase Free dH2O 8.5 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL，20 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，模板RNA 2.0 μL。RT-PCR 擴增程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR 擴增體系（總體積為25.0 μL）：RNase Free dH2O 8.5 μL，rTaqBuffer 12.5 μL，20 μmol/L 上游引物、下游引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。將陽性樣品PCR 產(chǎn)物委托北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進(jìn)行測序，通過Blast 分析確診病原。

2.6 同源性分析及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建

通過在NCBI 中下載相似及經(jīng)典序列作為參考序列，參考毒株信息見表2～3。采用clustW 進(jìn)行多序列比對及同源性分析，并應(yīng)用Neighbor-Joining 法通過MEGA6.0 構(gòu)建分子遺傳進(jìn)化樹。

表2 NDV 參考毒株信息

3 結(jié)果與分析

3.1 病原核酸檢測

對5 份雞呼吸系統(tǒng)疫病樣品進(jìn)行5 種病原的核酸檢測結(jié)果顯示：所獲目的條帶中，在約362 bp處有5 條帶與NDV 預(yù)期條帶相符且與陽性對照組處于同一長度位置，陰性對照組無相應(yīng)條帶（圖1）；在約784 bp 處有5 條帶與ORT 預(yù)期條帶相符且與陽性對照處于同一長度位置，陰性對照組無相應(yīng)條帶（圖2）。IBV、ILTV、AIV 沒有獲得目的條帶，檢測結(jié)果均為陰性。

圖1 樣品NDV RT-PCR 擴增結(jié)果

圖2 樣品ORT PCR 擴增結(jié)果

3.2 部分陽性樣品測序分析

對所獲的5 份陽性樣品隨機抽取2 份（YNKM-1、YNKM-2）進(jìn)行基因序列比對、同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建。

3.2.1 NDVF基因 測序結(jié)果顯示：樣品YNKM-1、YNKM-2 均與弱毒株相同位置的氨基酸序列相同，確定為弱毒株。同源性分析結(jié)果（圖3）顯示：YNKM-1、YNKM-2 與2013 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的KC844235、2005 年美國發(fā)現(xiàn)的Y18898 等毒株高度同源，同源性均為100%；與2011 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的JQ015296、2012 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的JN631747 等強毒株的同源性僅為65%～81%。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）顯示：YNKM-1、YNKM-2 與2013 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的KC844235、2005 年美國發(fā)現(xiàn)的Y18898 等基因型弱毒株處于一個大分支，親緣關(guān)系最近。因此，確定YNKM-1、YNKM-2 屬于Group Ⅱ型弱毒株。

圖3 NDV F 基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖4 NDV F 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

表3 ORT 參考菌株序列

3.2.2 ORT 16S rDNA 同源性分析結(jié)果（圖5）顯示：樣品YNKM-1、YNKM-2 的ORT 16S rDNA序列與2019 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MN023015、2007 年臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)的DQ195253 及2020 年波蘭發(fā)現(xiàn)的MW298723 等菌株具有較高的同源性，均為100%；與其他菌株的同源性為91.7%～99.7%?；蛳到y(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖6）顯示：此次云南省發(fā)現(xiàn)的YNKM-1、YNKM-2 ORT 16S rDNA 核苷酸序列與2019 年國內(nèi)大陸地區(qū)發(fā)現(xiàn)的MN023015、2007 年臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)的DQ195253 以及2020 年波蘭發(fā)現(xiàn)的MW298723 等菌株均在同一個分支上，屬于Group Ⅰ型。上述結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)該雞場感染了ORT，而且證明感染菌株的16S rDNA 基因在近幾年變異幅度較小。

圖5 ORT 16S rDNA 基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖6 ORT 16S rDNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 討論

我國的NDV 流行毒株主要為FJ882014、JN631747 等Group Ⅰ分支強毒株，其可以引起雞只大批量發(fā)病和死亡[6]。本患病雞場雞只也有較高死亡率，但本研究通過對NDVF基因進(jìn)行擴增和測序，確定該養(yǎng)殖場感染毒株為Group Ⅱ分支弱毒株，并非Group Ⅰ分支的強毒株或者疫苗株[7-10]。NDV Group Ⅱ分支弱毒株或者ORT 單獨感染通常不會表現(xiàn)出較高死亡率[11]，故推斷較高死亡率極可能是NDV 和ORT 混合感染所導(dǎo)致的。由于條件限制沒有做動物致病性試驗，無法最終驗證，但也為NDV、ORT 混合感染研究提供了一定的依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

近幾年，ORT 感染呈現(xiàn)全球流行趨勢，易感染動物種類繁多，尤其是禽類最易感[12]。但由于抗生素的濫用導(dǎo)致ORT 耐藥性不斷增強，建議經(jīng)藥敏試驗，選擇適當(dāng)抗生素進(jìn)行ORT 感染治療[13]。本研究通過基因序列比對和同源性分析，發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場感染的ORT 16S rDNA 基因在近幾年變異較小，且與此前云南省發(fā)現(xiàn)的YN11061、YN12071 同源性達(dá)100%，建議該養(yǎng)殖場在無法做藥敏試驗的情況下，可以把青霉素類和頭孢類作為治療的首選藥物[14]。

在雞日常生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，雞場很多傳染性疾病都有相似的臨床癥狀和病理特點。因而，僅僅通過發(fā)病雞的臨床癥狀和病理特點只能預(yù)估或推測大致的疾病范圍，難以最終確認(rèn)病因。本場雞群臨床表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病特征，通過PCR 技術(shù)分別擴增NDV、IBV、ILTV、AIV 的保守序列，只能擴增出NDV 特異性條帶；不同ORT 菌株的序列比對表明，99% 菌株的16S rDNA 序列相同[15]。而本研究設(shè)計合成的16S rDNA 特異性引物能與其他細(xì)菌區(qū)別，擴增出ORT 特異性條帶。據(jù)報道，雞群受到NDV 和IBV 混合感染后會引起雞群的大量死亡[16]，雞在同時感染NDV 弱毒株和腺病毒后也會出現(xiàn)較高的死亡率[6]。而本雞場雞群也很可能是因NDV 和ORT 混合感染導(dǎo)致發(fā)病嚴(yán)重。目前，引發(fā)雞呼吸系統(tǒng)疾病的病原較多，且混合感染較為普遍，因此需要加強多種病原混合感染的控制，養(yǎng)殖戶應(yīng)加強雞群的日常飼養(yǎng)管理，保持合理的養(yǎng)殖密度，保證雞群充足的營養(yǎng)水平，制定合理的免疫程序；如果發(fā)現(xiàn)病雞應(yīng)及時做好隔離，并采取針對性飼養(yǎng)管理措施，避免因交叉感染或混合感染導(dǎo)致雞群病情加重。