潘齊超，張 瞳，張耀鵬，朱 波

(1.東華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620; 2.上海大學(xué) 材料學(xué)院，上海 200444)

0 引言

石英晶體微天平(QCM)是一種對(duì)表面質(zhì)量負(fù)載變化敏感的傳感器件，可將其表面敏感材料與外界目標(biāo)物相互作用產(chǎn)生的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為頻率變化，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于傳感器領(lǐng)域[1]。

目前，隨著生物檢測(cè)領(lǐng)域的迫切需求和液相QCM理論的不斷完備，QCM技術(shù)開(kāi)始越來(lái)越多地應(yīng)用于液相生物傳感器中[2-4]。然而，液相生物環(huán)境中含有多種多肽、核酸和蛋白等干擾物，干擾物的黏附同樣會(huì)導(dǎo)致QCM頻率的變化。目前，為了提高傳感器的抗干擾能力，常采用牛血清蛋白等封閉劑對(duì)QCM傳感器進(jìn)行處理[5]，但這種外源封閉劑的方法操作復(fù)雜、封閉效果不穩(wěn)定。因此，QCM的抗干擾能力對(duì)液相生物分子的檢測(cè)至關(guān)重要[6]。

電化學(xué)傳感技術(shù)可將敏感材料與目標(biāo)物的相互作用直接轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，選擇性好和靈敏度高等特點(diǎn)。目前QCM傳感器的敏感材料常為非電活性材料，僅可實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的質(zhì)量傳感。如果QCM技術(shù)與電化學(xué)傳感技術(shù)聯(lián)用，可賦予QCM傳感器多重敏感能力，獲得更多的傳感信息并提高其抗干擾能力，有助于拓展其在生物傳感中的應(yīng)用。

導(dǎo)電高分子材料，尤其是聚3，4乙烯二氧噻吩(PEDOT)類材料具有較低的電化學(xué)阻抗、易于功能化、可通過(guò)電化學(xué)組裝到導(dǎo)電基底等優(yōu)點(diǎn)，可以方便地實(shí)現(xiàn)QCM表面的原位組裝，是制備電化學(xué)傳感器的優(yōu)選材料[7]。尤其是基于磷酸膽堿功能化的PEDOT材料(PEDOT-PC)，Zhu等[8]和Zhang等[9]證明了PEDOT-PC具備優(yōu)異的抗非特異性黏附能力，并且擁有良好的電化學(xué)性能，具有制備高選擇性傳感器的潛力。

針對(duì)目前QCM在生物傳感中的問(wèn)題，本研究將利用電化學(xué)原位沉積的方法，以生物素功能化的PEDOT(PEDOT-biotin)作為敏感材料的耦合單元，PEDOT-PC作為敏感材料的抗干擾單元，制備了生物分子敏感的QCM傳感器，其不但具有對(duì)鏈霉親和素的質(zhì)量和電化學(xué)復(fù)合敏感效應(yīng)，而且具有優(yōu)異抗其他蛋白干擾能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品及耗材

EDOT-Biotin和EDOT-PC為自制藥品；LiClO4來(lái)源于阿拉丁試劑有限公司；乙腈來(lái)源于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、鐵氰化鉀及亞鐵氰化鉀來(lái)源于上海泰坦股份科技有限公司；丁二酸二辛酯磺酸鈉(DSS)來(lái)源于上海西寶生物科技有限公司；鏈霉親和素和牛血清蛋白(BSA)來(lái)源于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；QCM芯片來(lái)源于瑞典百歐林(表面鍍金，基頻5 MHz)。

1.2 QCM傳感器的電化學(xué)制備方法

分別在含有50 mmol/L DSS和100 mmol/L LiClO4的乙腈溶液中配制10 mmol/L的EDOT-Biotin和EDOT-PC溶液。電化學(xué)聚合條件：以QCM芯片為工作電極，鉑網(wǎng)為對(duì)電極，Ag/Ag+為參比電極，將不同比例的EDOT-Biotin和EDOT-PC溶液混合并保持單體總濃度在10 mmol/L，通過(guò)循環(huán)伏安法對(duì)單體進(jìn)行聚合，掃描速度為0.1 V/s。經(jīng)過(guò)聚合試驗(yàn)步驟后的QCM芯片經(jīng)過(guò)乙腈沖洗、氮?dú)獯蹈珊蠹纯捎米鳛樯锓肿用舾械腝CM傳感器使用。

利用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)樣品形貌表征(型號(hào)：Genmini 300，Zeiss；電壓：5 kV)。利用X線光電子能譜分析(XPS)對(duì)樣品表面元素進(jìn)行分析(型號(hào)：K-alpha，Thermo Fisher；掃描范圍：400 μm)。利用接觸角對(duì)樣品親疏水性進(jìn)行表征(型號(hào)：THETA Auto，Atternsion；液滴大小為3 μL，接觸角計(jì)算模型為Young-Laplace)。

1.3 QCM的質(zhì)量和電化學(xué)傳感方法

使用配有電化學(xué)模塊的瑞典百歐林科技有限公司的Q.Sense E4設(shè)備表征樣品對(duì)生物分子的傳感能力。測(cè)試中流速均固定為30 μL/min，以流入10 min PBS為基線，再流入30 min 鏈霉親和素(50 μg/mL)或BSA(1 mg/mL)做耦合測(cè)試，最后流入30 min PBS對(duì)測(cè)試腔進(jìn)行清洗。其中當(dāng)QCM與電化學(xué)聯(lián)用時(shí)，其測(cè)試腔結(jié)構(gòu)如圖1所示。鉑片作為對(duì)電極，Ag/AgCl作為參比電極，功能化QCM芯片的正面作為工作電極，流動(dòng)相中需要加入5 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-作為氧還原探針。循環(huán)伏安法測(cè)試條件：掃描范圍為-0.4～0.6 V，掃描速度為100 mV/s。阻抗測(cè)試條件：偏壓為OCP，振幅為10 mV，頻率掃描范圍為0.1～100 000 Hz。

圖1 電化學(xué)石英晶體微天平裝置圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 生物分子敏感QCM傳感器的制備

功能化EDOT單體可以在施加氧化電勢(shì)的條件下發(fā)生聚合，進(jìn)而原位沉積到QCM芯片上，如圖2(a)所示。EDOT-PC和EDOT-Biotin單體各自的氧化電位不同，為了實(shí)現(xiàn)兩者可控的共聚合，本研究引入了DSS作為乳化劑，并且調(diào)控了循環(huán)伏安法的電勢(shì)范圍。隨著電勢(shì)升高，氧化電流不斷升高，不同共聚比例下的循環(huán)伏安曲線類似，表明功能化EDOT單體發(fā)生了可控的氧化聚合反應(yīng)，如圖2(c)所示，最終制備了具有均勻表面形貌的敏感材料，如圖2(b)所示。

圖2 電化學(xué)聚合、SEM形貌、不同投料比的電化學(xué)聚合曲線

為了定量分析敏感材料中不同功能化PEDOT所含的比例，我們通過(guò)XPS對(duì)敏感材料的表面元素進(jìn)行了分析。結(jié)合能在399.5 eV的峰是EDOT-PC中磷酸膽堿的N+元素引起的，402.5 eV的峰是EDOT-Biotin中生物素中N元素引起的，隨著EDOT-Biotin投料的增加，可以發(fā)現(xiàn)N元素的峰在逐漸增大，同時(shí)N+元素的峰在逐漸變小，如圖3(a)所示。通過(guò)控制電化學(xué)聚合中EDOT-Biotin單體的投料，可以實(shí)現(xiàn)敏感材料中EDOT-Biotin的含量控制，如圖3(b)所示。

圖3 不同EDOT-Biotin投料下制備的聚合物的表面元素分析

應(yīng)用于生物領(lǐng)域的敏感材料，為獲取和生物分子較好的親和力，需要滿足一定的親水性。本研究表征了不同EDOT-Biotin和EDOT-PC投料制備的敏感材料的親疏水性質(zhì)，如圖4所示。PEDOT-PC的接觸角在10°左右，PEDOT-Biotin的接觸角在60°以上，兩者共聚物的接觸角隨著EDOT-Biotin加入量的增加而變大，說(shuō)明磷酸膽堿基團(tuán)可顯著降低接觸角,提高敏感材料親水性。

圖4 不同投料下制備的聚合物接觸角數(shù)據(jù)及相應(yīng)的接觸角照片

2.2 生物分子敏感QCM的傳感性能研究

QCM傳感器的抗干擾能力是由敏感材料的抗非特異性黏附能力決定。本研究利用上述電化學(xué)方法在QCM上沉積制備了PEDOT-Biotin-co-PEDOT-PC敏感材料。

當(dāng)以BSA作為非目標(biāo)蛋白，可以發(fā)現(xiàn)在50%及以下投料EDOT-Biotin制備的敏感材料幾乎不會(huì)出現(xiàn)對(duì)高濃度下BSA(1 mg/mL)的非特異性黏附，而100% EDOT-Biotin投料下的敏感材料會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的非特異特異性黏附行為，如圖5(a)所示。本研究將鏈霉親和素(50 μg/mL)作為敏感材料捕獲的目標(biāo)物，其中敏感材料中的Biotin基團(tuán)可以與鏈霉親和素發(fā)生特異性的結(jié)合。隨著EDOT-Biotin投料的增加，敏感材料對(duì)鏈霉親和素的傳感能力逐步提高，在50 % EDOT-Biotin投料時(shí)擁有最大的傳感能力，如圖5(b)所示。

圖5 利用QCM表征不同投料EDOT-Biotin制備的聚合物膜

綜上說(shuō)明，功能化QCM傳感器的抗干擾能力來(lái)源于材料中的EDOT-PC單元。其中PC基團(tuán)的陽(yáng)離子和陰離子是嚴(yán)格1∶1存在的，且其空間位置很近，表現(xiàn)出理想的原位電荷中性，不會(huì)與生物分子發(fā)生電性吸引，另外PC與水間存在強(qiáng)烈的水合作用[10]，甚至在界面形成冰狀更致密的水分子網(wǎng)絡(luò)[11]，生物分子很難克服這層水分子網(wǎng)絡(luò)而產(chǎn)生黏附行為。這表明EDOT-PC和EDOT-Biotin修飾的QCM傳感器具備較強(qiáng)的抗干擾能力，并且可以對(duì)微克級(jí)別的鏈霉親和素實(shí)現(xiàn)傳感。

為了進(jìn)一步研究功能化QCM傳感器的電化學(xué)傳感能力，本研究在空白溶液及含有鏈霉親和素的溶液中加入[Fe(CN)6]4-/3-作為氧化還原探針，當(dāng)敏感材料界面捕獲鏈霉親和素時(shí)，鏈霉親和素會(huì)阻擋敏感材料界面的電子交換，進(jìn)而使傳感器的氧化還原電流變低，如圖6(a)所示。同時(shí)，功能化QCM與鏈霉親和素作用后，會(huì)使QCM傳感器低頻處的阻抗明顯升高，如圖6(b)所示。結(jié)果表明，通過(guò)電化學(xué)氧化還原信號(hào)及電化學(xué)阻抗信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的傳感，從而實(shí)現(xiàn)QCM與電化學(xué)的聯(lián)用傳感。

圖6 功能化QCM傳感器在加入鏈霉親和素前后

3 結(jié)束語(yǔ)

針對(duì)傳統(tǒng)QCM傳感器不適用同時(shí)質(zhì)量和電化學(xué)傳感的局限性，以及抗干擾能力不足的問(wèn)題，本研究利用功能化導(dǎo)電高分子優(yōu)異的電化學(xué)性能及抗干擾能力，借助電化學(xué)沉積的方法成功制備生物分子敏感的QCM傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鏈霉親和素的質(zhì)量和電化學(xué)傳感，同時(shí)具備較強(qiáng)抗干擾能力的目標(biāo)。該生物分子敏感QCM傳感器的制備，將有助于未來(lái)開(kāi)發(fā)高選擇性多重敏感能力的生物分子傳感器。