韓盧，梁朝遠，石思偉，楊立群，鄧雄威，盛望

1.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124；2.國家納米科學中心，北京 100190

有報道顯示，2018年全球惡性腫瘤新發(fā)病率約1 808 萬例，死亡病例約956 萬例，中國分別占約23.7%和30%［1］。美國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)及中國腫瘤流行統(tǒng)計數(shù)據(jù)均表明，結(jié)腸直腸癌導致死亡的病例數(shù)列第三位［2?3］。目前，手術是治療結(jié)腸直腸癌的首選途徑，但存在術后復發(fā)的可能，雖然放化療可在一定程度上可防止腫瘤復發(fā)，但部分患者存在不適合及副反應大的情況［4?5］，預后效果仍不理想。因此，亟需尋找預防和治療結(jié)腸直腸癌的新方法。

有研究表明，腫瘤疫苗可激活患者的免疫系統(tǒng)，使其識別腫瘤相關抗原（tumor?associated antigens，TAAs），從而破壞腫瘤細胞，防止腫瘤復發(fā)［6］。目前，多數(shù)腫瘤疫苗均是將TAAs和免疫輔助劑組合，免疫機體后激活樹突狀細胞（dendritic cells，DCs），產(chǎn)生信號，誘導CD8+T 細胞成熟，分化為TAAs 特異性細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）。腫瘤疫苗主要通過主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）途徑發(fā)揮作用，DCs識別腫瘤細胞抗原后，經(jīng)其表面MHC提呈，使T細胞活化、增殖，活化的T 細胞從血管中遷移至腫瘤部位，浸潤腫瘤，進行特異性殺傷腫瘤細胞。多數(shù)TAAs 均在腫瘤細胞膜表面，裂解腫瘤細胞可獲得含有多種特征和非特征的抗原，用其制備的腫瘤疫苗可針對患者體內(nèi)多種TAAs［7］。這種腫瘤疫苗的制備過程簡單、成本低，但其免疫原性較弱，抗原提呈細胞對其攝取效率較低。生物納米顆?？勺鳛橐呙绲淖魟┘翱乖陌b載體，增強細胞對腫瘤裂解物的吸收，促進激活抗原提呈細胞，包括殼聚糖納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒、納米脂質(zhì)體、聚多巴胺納米顆粒等［8?11］。CpG1826 為一段寡核苷酸，是具有較強的抗腫瘤作用一種DNA 佐劑［12］。本課題組前期研究組裝了納米遞送系統(tǒng)，構建β 葡聚糖?CpG 復合佐劑納米顆粒，且具有良好的佐劑刺激效果［13?14］，也可用于包裝新抗原［15］，表明納米化的CpG 可作為載體和佐劑用于疫苗的制備。本研究采用納米化的CpG 與結(jié)腸癌腫瘤細胞裂解液分別于體外刺激小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow?derived dendritic cells，BMDCs）成熟后，按一定比例混合，制備腫瘤裂解物納米疫苗，免疫小鼠后，檢測小鼠體內(nèi)細胞因子的分泌水平，評價該疫苗在動物體內(nèi)的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 細胞 C57BL／6小鼠結(jié)腸癌細胞系MC38細胞購自北京協(xié)和細胞庫，由北京工業(yè)大學環(huán)生學部保存。

1.2 主要試劑及儀器 CpG1826由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；CpG β?葡聚糖納米顆粒（CpG β?glucan nanoparticles，CNP）由北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部按文獻［14］方法制備；粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte?macrophage colony?stimulating factor，GM?CSF）及白細胞介素?4（interleukin?4，IL?4）均購自美國 Peprotech 公司；IL?6、IL?12p40、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）和干擾素γ（interferon γ，IFNγ）ELISA 檢測試劑盒、anti?CD11c?FITC、anti?MHC?Ⅱ?PE、anti?CD80?APC、anti?CD86?Percpcy5.5、anti?CD3?FITC、anti?CD8?PE 及 TruStain FcXTMPLUS（anti?mouse16／32）抗體封閉液均購自美國 BioLegend 公司 ；RPMI1640 培養(yǎng)基、FBS 及 PBS（pH 7.4）均購自美國Gibco 公司；紅細胞裂解液、PBS?EDTA、ELISA 終止液及小鼠淋巴分離液均購自北京達科為生物技術有限公司；70 μm 篩網(wǎng)及FACS流式細胞儀（FACS Calibur型）購自美國BD公司。

1.3 實驗動物 SPF 級C57BL／6J小鼠，雌性，30只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物合格證號為：SCXK（京）2019?0010，飼養(yǎng)于北京神瑞生物技術有限公司動物房。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關規(guī)定進行（文件號為：PONY?BG356?2018A）。

1.4 小鼠BMDCs 的分離 將2 只小鼠脫頸處死，浸泡于75%酒精中，進行表面消毒處理；隨后無菌取小鼠的脛骨和股骨，置75%酒精中浸泡5 min；剔除骨頭上殘留肌肉，PBS 洗滌干凈；用RPMI1640 培養(yǎng)液沖洗骨髓，收集培養(yǎng)液，經(jīng)70 μm 篩網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿，室溫靜置30 min；收集未貼壁細胞，800 ×g離心 5 min，棄上清，用 RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。將獲得的BMDCs 按4 × 106個／孔加至6孔板，再加入RPMI1640培養(yǎng)基（含10%FBS、1%PBS、20 ng／mL GM?CSF和10 ng／mL IL?4），4 mL／孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，更換新培養(yǎng)基；培養(yǎng)5 d時，半量更換新培養(yǎng)基；培養(yǎng)7 d，收集懸浮細胞，800×g離心5 min，棄上清，加入1 mL培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。

1.5 BMDCs 的體外刺激試驗 將BMDCs 細胞液濃度調(diào)整為1×106個／mL，加入24孔板，1 mL／孔，于37 ℃培養(yǎng)24 h。將BMDCs分為PBS組（2 μL／孔）、NP組（無CpG 納米顆粒，2 μg／孔）、Lysate 組（MC38 細胞裂解物，2 μg／孔）、CpG 組（CpG1826，2 μg／孔）、CNP組（CNP，2 μg／孔），每組均設3個復孔，于37 ℃培養(yǎng) 24 h；收集細胞，用anti?CD11c?FITC、anti?MHC?Ⅱ?PE、anti?CD80?APC、anti?CD86?Percpcy5.5 混合液（等體積比混合）染色30 min，上流式細胞儀檢測；收集培養(yǎng)上清，采用相應ELISA 試劑盒測定IL?6 及IL?12p40的含量。

1.6 腫瘤裂解物納米疫苗的制備 用含10% FBS 和1%PS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基，于 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MC38 細胞，待長滿單層后，用PBS 洗滌1 次，0.25%胰酶消化，800×g離心5 min；棄上清，用1 mL PBS 重懸，計數(shù)，調(diào)整密度為1× 107個／mL，置液氮冷凍5 min；迅速轉(zhuǎn)移至37 ℃水浴5 min，反復凍融5次，4 ℃，2 000 ×g離心10 min；取上清，即腫瘤裂解物，BCA法檢測蛋白濃度，于-20 ℃保存。將200 mg／mL CNP 和 50 mg／mL 腫瘤裂解物按 1∶1 的體積比混合，制備成腫瘤裂解物納米疫苗。

1.7 動物分組及給藥 將小鼠適應性飼養(yǎng)約5 d，隨機分為4組：PBS組、CNP組、Lysate組、Vaccine 組，分別經(jīng)小鼠皮下注射PBS（100 μL／只）、CNP［20 μg／（100μL·只）］、MC38細胞裂解物［50μg／（100μL·只）］、腫瘤裂解物納米疫苗（100 μL／只），每組5 只。每周免疫1 次，連續(xù)給藥3 次，末次免疫后1 h，經(jīng)小鼠右下肢皮下接種MC38 細胞，2×105個／只，于接種后3、6、9 d 測量并記錄各組小鼠體內(nèi)腫瘤的最大直徑和最小直徑，并按下式計算腫瘤體積。以時間為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標，繪制腫瘤生長曲線。

腫瘤體積（cm3）=1／2×最大直徑（cm）×最小直徑（cm）2

1.8 各組小鼠血液中 IFNγ 和 TNF?α 含量的檢測最后一次測量腫瘤體積后，用10%水合氯醛麻醉小鼠，經(jīng)眼眶采血，置EDTA抗凝管，800×g離心10 min，取上層血漿，采用相應ELISA 試劑盒測定其IFNγ 和TNF?α 含量；下層血漿于-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.9 各組小鼠血液中CD3+CD4+T 及CD3+CD8+T細胞比例的檢測 取下層血液，加入1 mL PBS，用滴管將稀釋血液沿試管壁緩慢加至含有2 mL 淋巴細胞分離液的離心管中，于4 ℃，1 500×g離心20 min；取中間白膜層，即外周血單核細胞，用PBS洗滌1次，加入 TruStain FcXTMPLUS（anti?mouse16／32）抗體封閉液，室溫封閉5 min；分別加入anti?CD80?APC、anti?CD3?FITC、anti?CD8?PE，室溫避光孵育 20 min；PBS洗滌1 次，制成單細胞懸液，經(jīng)流式細胞儀檢測，應用FlowJo 10.0軟件分析檢測結(jié)果。

1.10 小鼠脾細胞中 IFNγ 和 TNF?α 含量的檢測1.8項小鼠采血后，經(jīng)脫頸處死，無菌取小鼠脾臟，置RPMI1640 培養(yǎng)基中，于 70 μm 篩網(wǎng)中研磨，用 PBS沖洗篩網(wǎng)，收集細胞，800 ×g離心5 min；棄上清，加入5 mL紅細胞裂解液，于冰上裂解5 min；加入10 mL PBS?EDTA 終止反應，于室溫，800 ×g離心 5 min；棄上清，用 2 mL 含 10% FBS 和 1% PS 的 RPMI1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。將小鼠脾細胞加至96 孔板，1×106個／孔，加入MC38腫瘤裂解物，40 μg／孔，37 ℃刺激72 h；收集上清，用相應ELISA 試劑盒檢測IFNγ和TNF?α含量。

1.11 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，GraphPad Prism 6.0 軟件繪制圖表，試驗數(shù)據(jù)均以均值 ± 標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMDCs 的體外刺激試驗 CNP 組 BMDCs 表面標志物CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC?Ⅱ+的表達水平明顯高于CpG、PBS、NP 及Lysate 組（t=4.3 ~ 20.5，P均 < 0.05），見表 1。表明 CNP 可促進BMDCs 成熟。CNP 組 BMDCs 的培養(yǎng)上清中 IL?6 和IL12p40 含量明顯高于CpG、PBS、NP 及Lysate 組（t=5.8 ~ 46.2，P均 < 0.01），見表 2。表明 CNP 可顯著提高BMDCs分泌IL?6和IL12p40的水平。

表1 各組BMDCs表面標志分子的表達情況（%，，n=3）Tab.1 Expression of marker molecules on cell surface of BM?DCs in various groups（%，，n=3）

表1 各組BMDCs表面標志分子的表達情況（%，，n=3）Tab.1 Expression of marker molecules on cell surface of BM?DCs in various groups（%，，n=3）

注：與 CNP 組比較，a 表示 P < 0.05；aa 表示 P < 0.01；aaa 表示P<0.001。

組別CNP CpG PBS NP Lysate CD11c+CD80+30.0±1.5 22.0±2.0aa 12.0±0.2aaa 12.0±0.6aaa 14.7±0.1aaa CD11c+CD86+27.0±1.6 19.7±1.4aa 12.5±1.1aaa 13.3±2.7aa 12.7±2.7aaa CD11c+MHC?Ⅱ+24.7±1.3 19.4±1.7a 13.8±1.3aaa 12.9±0.4aaa 13.6±1.1aaa

表2 BMDCs培養(yǎng)上清中IL?6和IL12p40的含量（pg／mL，，n=3）Tab.2 Contents of IL?6 and IL?12p40 in the supernatant of BM?DCs（pg／mL，，n=3）

表2 BMDCs培養(yǎng)上清中IL?6和IL12p40的含量（pg／mL，，n=3）Tab.2 Contents of IL?6 and IL?12p40 in the supernatant of BM?DCs（pg／mL，，n=3）

注：與CNP組比較，aa表示P<0.01；aaa表示P<0.001。

IL?6 8 398.8±313.5 3 380.6±1 115.1aa 31.2±6.1aaa 34.6±3.2aaa 33.4±7.1aaa IL12p40 10 867.3±1 072.2 5 028.4±1 386.8aa 19.3±1.3aaa 23.0±2.9aaa 19.9±4.7aaa組別CNP CpG PBS NP Lysate

2.2 小鼠體內(nèi)腫瘤的生長曲線 Vaccine組小鼠體內(nèi)的腫瘤體積明顯小于PBS、CNP、Lysate 組（t分別為3.4、2.7、2.6，P均 < 0.05）；Lysate 組小鼠體內(nèi)的腫瘤體積雖略小于PBS 組和CNP 組，但差異均無統(tǒng)計學意義（t分別為1.9和1.3，P均 <0.05）。見圖1。

2.3 小鼠血液中IFNγ 和 TNF?α 的含量 Vaccine 組小鼠血液中的IFNγ 含量明顯高于PBS、CNP、Lysate組（t分別為4.6、4.6、3.8，P均 < 0.05），TNF?α 含量與其他3 組差異無統(tǒng)計學意義（t分別為2.0、1.1、0.4，P均 >0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清中IFNγ 和TNF?α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.3 Contents of IFN γ and TNF?α in serum of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

表3 各組小鼠血清中IFNγ 和TNF?α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.3 Contents of IFN γ and TNF?α in serum of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

注：a表示與Vaccine組比較，P<0.05。

IFNγ 169.5±77.3 10.7±0.3a 11.2±0.8a 30.7±28.0a TNF?α 12.9±0.3 13.4±0.5 12.3±1.2 12.3±0.4組別Vaccine PBS CNP Lysate

2.4 小鼠血液中的 CD3+CD4+T 及 CD3+CD8+T 細胞比例 Vaccine 組小鼠血液中CD3+CD8+T 細胞比例與PBS、CNP、Lysate 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t分別為0.5、0.6、0.7，P均 > 0.05）；Vaccine 組小鼠血液中CD3+CD4+T 細胞比例略高于其他組，但差異也無統(tǒng)計學意義（t分別為 0.7、0.9、1.9，P均 >0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血液中的CD3+CD4+ T 及CD3+CD8+ T 細胞比例（%，，n=5）Tab.4 Proportion of CD3+ CD4+ T and CD3+CD8+ T cells in blood of mice in various groups（%，，n=5）

表4 各組小鼠血液中的CD3+CD4+ T 及CD3+CD8+ T 細胞比例（%，，n=5）Tab.4 Proportion of CD3+ CD4+ T and CD3+CD8+ T cells in blood of mice in various groups（%，，n=5）

組別Vaccine PBS CNP Lysate CD3+CD8+T 13.6±1.9 12.6±2.1 14.1±0.6 13.2±1.2 CD3+CD4+T 13.3±3.5 12.1±1.2 11.6±2.2 10.1±1.1

2.5 小鼠脾臟中 IFNγ 和TNF?α 的含量 Vaccine 組小鼠脾臟中 IFNγ 和 TNF?α 含量均明顯高于 PBS、CNP、Lysate 組（t分別為 6.3 ~ 13.0，P均 < 0.001），見表5。

表5 各組小鼠脾臟中IFNγ 和TNF?α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.5 Contents of IFN γ and TNF?α in spleen of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

表5 各組小鼠脾臟中IFNγ 和TNF?α 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.5 Contents of IFN γ and TNF?α in spleen of mice in various groups（pg／mL，，n=5）

注：aaa表示與Vaccine組比較，P<0.001。

組別Vaccine PBS CNP Lysate IFNγ 2 807.5±952.3 79.0±36.3aaa 76.1±20.5aaa 375.7±154.7aaa TNF?α 70.3±7.4 23.8±6.2aaa 21.8±4.0aaa 38.6±8.6aaa

3 討 論

目前，疫苗接種是癌癥免疫預防的最佳途徑，如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗。疫苗接種具有安全性高、可產(chǎn)生長期記憶、成本低、供給方便等優(yōu)勢，不僅可單獨使用，還可聯(lián)合其他方法使用［16］。腫瘤裂解物疫苗具有制備方法簡單，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，疫苗中含有大量免疫原性表位，可通過體液免疫與細胞免疫途徑發(fā)揮作用，達到預防或治療的作用。腫瘤裂解物與佐劑的聯(lián)合使用，尤其是納米化的佐劑，可增強體內(nèi)的免疫效果。CpG 寡核苷酸是通過 Toll 樣受體 9（Toll?like receptor 9，TLR9）發(fā)揮免疫激活作用［17?18］，與其他TLR不同，TLR9存在于細胞內(nèi)，CpG 寡核苷酸通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞后與TLR9 結(jié)合。腫瘤裂解物進入體內(nèi)，被DCs 吞噬，經(jīng)抗原遞呈給T 細胞促進其分化為特異性CTL。佐劑CpG可增強該過程，從而促進免疫應答效果。DCs作為功能最強的抗原提呈細胞，在先天免疫和適應性免疫關系中起重要作用。未成熟的DCs表現(xiàn)出強大的捕獲抗原能力，但不能有效地處理抗原和刺激T 細胞。攝取抗原后，未成熟的DCs 分化為成熟的DCs，同時表型和功能也發(fā)生變化。成熟的DCs 表達高水平的表面標志物（如MHC?Ⅱ、CD80和CD86等），促進抗原呈遞并分泌細胞因子［19］。在相同的劑量下，納米化 CpG 可比非納米化 CpG 激活更強的免疫應答［20］。臨床前和臨床研究中，由于CpG 寡核苷酸能夠啟動腫瘤微環(huán)境中的免疫激活，打破免疫抑制和治療耐受，可用于治療各種癌癥，因此受到廣泛關注［21］。

本研究用CNP 體外刺激BMDCs 成熟，結(jié)果顯示，相同劑量CNP比CpG表現(xiàn)出了更好的刺激效果，明顯促進了細胞因子IL?6和IL?12p40的表達（P均 <0.01），增強了細胞免疫和體液免疫效果。小鼠皮下接種疫苗后，MC38 腫瘤生長緩慢，腫瘤體積明顯小于其他組（P均< 0.05），表現(xiàn)出良好的免疫預防效果；CD3+CD8+T及CD3+CD8+T細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義（P均 >0.05）；血液中IFNγ 含量明顯升高（P均 < 0.05），TNF?α 含量差異無統(tǒng)計學意義（P均 > 0.05）；脾臟中IFNγ 及TNF?α 含量均明顯升高（P均<0.001），顯示出了良好的抗腫瘤效果。

綜上所述，構建的CNP 能夠有效激活并促進DCs 成熟，增強 IL?6 和 IL?12p40 等細胞因子的分泌，提高體液和細胞免疫水平；與腫瘤裂解物聯(lián)合制備成的疫苗，在結(jié)腸癌小鼠模型中具有良好的預防效果，也促進了體內(nèi)的抗腫瘤細胞因子的釋放，為腫瘤預防和治療提供了新的思路和策略。另外，本研究中各組小鼠數(shù)量較少，難免影響檢測結(jié)果，因此，后續(xù)研究中將增加各組小鼠數(shù)量，以期獲得更準確的結(jié)果。