程日娜，王曉宇，馬慶，孔令華，張宇奇，秦凱莉，趙瑩珠，蘇丹，弓韜，郭睿

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001

根據(jù)2020年全球癌癥報(bào)告最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌全球發(fā)病率居第六位，中國(guó)發(fā)病率居第四位［1］。肝癌仍為我國(guó)主要的癌癥之一。肝癌預(yù)后較差，因此，早期治療多選擇手術(shù)切除，晚期多服用化療藥物進(jìn)行治療［2?3］。但長(zhǎng)期使用化療藥物不僅具有較大的毒性，且易產(chǎn)生耐藥性，因此，探索新的肝癌治療方案尤為重要［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)脂酰輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（acyl?coenzyme A：cholesterol acylt?ransferase，ACAT）可有效抑制肝細(xì)胞癌的遷移和增殖［5］。ACAT 又稱固醇?O ?；D(zhuǎn)移酶（sterol O?acylt?ransferase，SOAT），屬于膜結(jié)合O?酰基轉(zhuǎn)移酶（mem?brane?bound O?acyltransferase，MBOAT）家族，是一種細(xì)胞內(nèi)酶［6?8］。1993年，ACAT基因第 1 次被鑒定，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已被證明有SOAT1 以及SOAT2兩種亞型［9?10］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，SOAT 在肝細(xì)胞中的活性90%主要是同工酶SOAT1發(fā)揮作用［10］。

SOAT 可催化膽固醇以膽固醇脂（cholesteryl esters，CE）的形式儲(chǔ)存于脂質(zhì)滴中。研究表明，在多類腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)滴數(shù)量較高，相比于正常組織，CE已被證明是脂質(zhì)滴的主要成分［11］。因此，針對(duì)CE 的儲(chǔ)存可成為治療癌癥的一個(gè)潛在指標(biāo)［10，12］。LI 等［13］報(bào)道了膽固醇酯化與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示，通過(guò)抑制SOAT1 活性減少CE 的生成可顯著抑制原位小鼠胰腺癌腫瘤的生長(zhǎng)。SOAT1的表達(dá)是調(diào)節(jié)胰腺癌的一個(gè)潛在標(biāo)志。BEMLIH 等［14］則發(fā)現(xiàn)了一種新型SOAT1 抑制劑來(lái)治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，通過(guò)使用該抑制劑明顯降低了SOAT1表達(dá)以及CE的數(shù)量，從而抑制了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，JIANG 等［5］通過(guò)蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SOAT1 可作為肝癌S?Ⅲ亞型的標(biāo)記物以及治療靶標(biāo)。

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)SOAT1基因的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、相關(guān)功能以及蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行分析，深入探索SOAT1基因相關(guān)的肝癌發(fā)病機(jī)制，以期為肝癌的相關(guān)治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1SOAT1基因與蛋白質(zhì)的相關(guān)信息 通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechno?logy Information，NCBI）獲得，網(wǎng)址：https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／。

1.2SOAT1基因的生物信息學(xué)分析 SOAT1相關(guān)信息由以下軟件分析預(yù)測(cè)：ProtParam（http：／／web.expasy.org／protparam／）、Protscale（http：／／web.expasy.org／protscale／）、SignalP 4.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP?4.0／）、TMHMM Server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）。采用以下軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SOAT1的組織表達(dá)特異性和亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析：NCBI 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)、PSORT Ⅱ（https：／／psort.hgc.jp／form2.html）。采用以下軟件對(duì)SOAT1 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)：NCBI 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)、SOPMA（https：／／npsa?prabi.ibcp.fr／cgi?bin／npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS ?MODEL（https：／／swissmodel.expasy.org／）。SOAT1的蛋白 互作關(guān)系預(yù)測(cè)軟件：STRING（http：／／string?db.org／）。采用以下軟件得到SOAT1 的翻譯后位點(diǎn)修飾情況：NetNGlyc1.0Sever（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）、NetOGlyc4.0Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／）、Netphos 3.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）。

2 結(jié)果

2.1 SOAT1 的基本性質(zhì) 登錄NCBI 官網(wǎng)對(duì)SOAT1基因進(jìn)行檢索分析，SOAT1基因定位于人1號(hào)染色體1q25.2，外顯子個(gè)數(shù)為17。SOAT1 蛋白的GenBank序列號(hào)為AAH28940.1，共有550 個(gè)氨基酸殘基，分子量為64 734.61，分子式為C3059H4541N743O767S23。經(jīng)ProtParam 分析統(tǒng)計(jì)，SOAT1 蛋白中亮氨酸（Leu）所占比例最高，達(dá)11.10%；而半光氨酸（cys）所占比例最低，僅為1.60%。SOAT1 蛋白中帶負(fù)電的殘基總數(shù)（天冬氨酸殘基+谷氨酸殘基）為46，帶正電的氨基酸殘基總數(shù)（精氨酸+賴氨酸）為58，理論等電點(diǎn)（PI）為9.08，因此，該蛋白偏堿性。ProtParam 軟件同時(shí)給出該蛋白在水中280 nm 測(cè)得的消光系數(shù)。假設(shè)所有成對(duì)的cys殘基均形成胱氨酸時(shí)，Abs 0.1%（= 1 g／L）為 1.950，消光系數(shù)為126 210 M?1cm?1；當(dāng)所有cys殘基均消除時(shí)，Abs 0.1%（=1 g／L）為1.942，消光系數(shù)為125 710 M?1cm?1。此外，該蛋白在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，其中不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為36.71，低于閾值（40），因此為穩(wěn)定蛋白。其中脂肪指數(shù)達(dá)92.67，親水性平均值（GRAVY）為0.190。

Protscale 軟件對(duì)SOAT1 蛋白的親水性分析顯示，最低點(diǎn)分別為位于 21 和 24 位谷氨酸，23 和 25 位天冬氨酸，得分均為-3.400；而最高點(diǎn)位于150 位的異亮氨酸，得分為3.700。SOAT1的大部分氨基酸殘基位于0 點(diǎn)以上的疏水區(qū)域，且ProtParam 預(yù)測(cè)該蛋白親水性平均值為0.190，兩者結(jié)論一致，因此，該蛋白為疏水性蛋白質(zhì)。見(jiàn)圖1。

圖1 SOAT1蛋白的親疏水性分析Fig.1 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of SOAT1 protein

使用SignalP 4.0 Server 對(duì)SOAT1 信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，其中C 為區(qū)分是否為反應(yīng)切位點(diǎn)，S 判斷是否為分泌蛋白，Y 值為前兩者的綜合分析。分析顯示，C 值最大位于 66 位，得分為 0.109；Y 值最大則位于38 位，得分為0.111。這些值均未達(dá)到閾值，因此預(yù)測(cè)SOAT1 為無(wú)信號(hào)肽。見(jiàn)圖2。此外，SecretomeP 2.0a Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／／）對(duì)非經(jīng)典蛋白質(zhì)分泌做出了預(yù)測(cè)，該蛋白的NN?得分為0.731，超過(guò)了哺乳動(dòng)物推薦閾值（0.6），因此，SOAT1為非經(jīng)典分泌蛋白。

圖2 SOAT1蛋白的信號(hào)肽分析Fig.2 Signal peptide analysis of SOAT1 protein

由 TMHMM Server v.2.0 對(duì) SOAT1 的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，SOAT1 蛋白存在8 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，1?139 位于膜內(nèi)，163?183 位于膜外，204?223 位于膜內(nèi)，247?317 位于膜外，341?360 位于膜內(nèi)，384?436位于膜外，460?463位于膜內(nèi)，487?500位于膜外，519?550位于膜內(nèi)，是一個(gè)跨膜蛋白。見(jiàn)圖3。

圖3 SOAT1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of transmembrane structure of SOAT1 protein

2.2 SOAT1的組織表達(dá)特異性和亞細(xì)胞定位 使用NCBI 中Nucleotide 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)來(lái)自27 個(gè)不同組織的95 個(gè)人的組織樣本進(jìn)行RNA?Seq，結(jié)果顯示，SOAT1在腎上腺中表達(dá)量最高，其中每百萬(wàn)reads 中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)（reads per kilobase per million mapped reads，RPKM）為（68.851 ± 5.939）；在皮膚組織中表達(dá)量最低，RPKM 為（1.012± 0.286）。見(jiàn)圖4。對(duì)SOAT1 進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白大部分存在于細(xì)胞膜中，占比為73.90%；少部分位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，占比分別為21.70%和4.30%。

圖4 SOAT1在正常組織中的表達(dá)特異性Fig.4 Expression specificity of SOAT1 in normal tissues

2.3 SOAT1 的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 通過(guò)SOPMA 軟件預(yù)測(cè)SOAT1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α?螺旋為主要結(jié)構(gòu)，占比51.82%，是SOAT1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成原件；其次為無(wú)規(guī)則卷曲，占31.45%；延伸鏈和β?轉(zhuǎn)角分別占比13.09%和3.64%。見(jiàn)圖5。綜上，該蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定維持，因此可更好地發(fā)揮蛋白質(zhì)相應(yīng)功能。

圖5 SOAT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of secondary structure of SOAT1 protein

使用NCBI Conserved Domain 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性對(duì)比，氨基酸序列第171?520 位屬于MBOAT 超家族結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖6。膜蛋白的MBOAT 家族包含多種?；D(zhuǎn)移酶。

圖6 SOAT1的保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conserved domain of SOAT1

使用 SWISS?MODEL 對(duì) SOAT1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，該軟件使用了8 個(gè)模板進(jìn)行建模，得到了1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模板。該模型氨基酸序列的模型覆蓋率為88%，GMQE 為0.61，QMEAN 為-4.98。因此該模型是標(biāo)準(zhǔn)三級(jí)結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖7。

圖7 SOAT1蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of tertiary structure of SOAT1 protein

2.4 SOAT1 翻譯后修飾位點(diǎn) NetNGlyc 1.0 Sever對(duì)N?糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，可能具有4 個(gè)N?糖基化位點(diǎn)，而只有2 個(gè)超過(guò)閾值，為最可能的糖基化位點(diǎn)，分別位于319（得分為0.506 4）和406 位（得分為0.550 4）。使用NetOGlyc 4.0 Server 軟件預(yù)測(cè)O?糖基化位點(diǎn)，一共預(yù)測(cè)出3 個(gè)位點(diǎn)，分別位于33、286和 287 位，對(duì)應(yīng)的得分分別為0.509 134、0.523 38 和0.759 24。因此，287 位可能是主要的O?糖基化位點(diǎn)。而Netphos 3.1 Server 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，可能有46個(gè)磷酸化位點(diǎn)，得分大于0.9的位點(diǎn)可達(dá)14個(gè)，其中16位絲氨酸、71位絲氨酸以及127位絲氨酸得分，均為0.992，因此可能性最大。

2.5 SOAT1 的蛋白相互作用關(guān)系預(yù)測(cè) STRING 軟件對(duì)SOAT1進(jìn)行了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，設(shè)置置信度大于 0.7，結(jié)果 SOAT1 與 10 個(gè)蛋白（CYP46A1、CYP27A1、CYP7A1、CYP11A1、DHCR24、DHCR7、DH?CR24、CH25H、SOAT2、STS）有密切聯(lián)系。見(jiàn)圖8。

圖8 SOAT1的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Protein interaction network of SOAT1

SOAT1 涉及到的KEGG 通路見(jiàn)表1，該蛋白主要參與的信號(hào)通路有6 種，其中hsa00120、hsa00100、hsa04979、hsa00140 等通路均與脂質(zhì)類代謝通路相關(guān)。且SOAT1 蛋白還參與了PARP 通路，與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)。此外，GO分析同樣顯示了SOAT1與相關(guān)蛋白參與膽固醇的生物合成以及分解代謝，見(jiàn)表2。

表1 SOAT1蛋白網(wǎng)絡(luò)中涉及到的KEGG通路分析Tab.1 Analysis of KEGG pathway involved in SOAT1 protein network

表2 SOAT1的GO分子功能分析Tab.2 GO molecule function analysis of SOAT1

3 討論

SOAT1 已被證明與多種癌癥的進(jìn)展有關(guān)，近年來(lái)尤其發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞癌具有一定的聯(lián)系。通過(guò)使用生物信息學(xué)工具分析發(fā)現(xiàn)，SOAT1 是一種疏水性蛋白，屬于膜蛋白的MBOAT 家族，具有8 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，大部分位于細(xì)胞膜中，屬于非經(jīng)典途徑蛋白。SOAT1 蛋白在多種組織細(xì)胞均有表達(dá)，但大部分位于腎上腺組織，在皮膚組織表達(dá)最低。蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)多為與膽固醇合成代謝相關(guān)蛋白。經(jīng)預(yù)測(cè)，有2 個(gè)高可信度N?糖基化位點(diǎn)、3 個(gè)O?糖基化位點(diǎn)以及14 個(gè)可信度高的磷酸化位點(diǎn)，因此，多種功能修飾證明SOAT1在膽固醇代謝途徑的關(guān)鍵作用。

KEGG 通路以及 GO 分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SOAT1 蛋白主要參與的是膽固醇的合成以及分解代謝過(guò)程，其中預(yù)測(cè)到SOAT1 同時(shí)也參與PARP 通路。在多種代謝途徑，脂質(zhì)代謝一直被認(rèn)為與癌癥的遷移相關(guān)［13］，通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，多種類型癌細(xì)胞中膽固醇積累較高，而PARP 通路又是經(jīng)典的凋亡通路［15］，臨床多通過(guò)使用PARP 抑制劑調(diào)節(jié)該通路實(shí)現(xiàn)癌癥的治療［5，14］。異常的膽固醇常誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激以及凋亡的發(fā)生。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得到的相關(guān)蛋白，如 CYP46A1、CYP27A1、CYP7A1、CYP11A1 等均是膽固醇代謝通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，對(duì)維持膽固醇的穩(wěn)定具有重要作用。此外，與SOAT1 蛋白相互作用的DH2R24 蛋白被證實(shí)在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于肝細(xì)胞，且DH2R24 可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白caspase 3 的表達(dá)［16］。不僅如此，STRING 分析所得到的其他蛋白也被相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道參與凋亡的調(diào)節(jié)［13，16］，因此推斷SOAT1與細(xì)胞的凋亡進(jìn)展具有緊密的聯(lián)系。已有研究闡明膽固醇的調(diào)節(jié)通路與PARP 通路均與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5，14］，綜合對(duì)比 SOAT1 的預(yù)測(cè)結(jié)果，可以推斷SOAT1 與多種蛋白質(zhì)相互作用參與兩種信號(hào)通路，最終導(dǎo)致膽固醇異常積累以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而影響肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抑制SOAT1在多種癌癥治療中具有一定的作用，近年SOAT1 被預(yù)測(cè)作為S?Ⅲ亞型的標(biāo)記物以及治療靶標(biāo)，通過(guò)生物信息學(xué)研究預(yù)測(cè)該蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能，使得對(duì)SOAT1 與肝細(xì)胞癌相互作用的機(jī)制有了一定的了解，但具有一定的局限性。更加深入的作用機(jī)理還需通過(guò)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行分析。