袁美麗 ，王楚彤 ，李敏英 ，李柏青 ，3，許濤 ，4，汪洪濤 ，3

1.蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院檢驗醫(yī)學實驗中心，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學院慢性疾病免疫學基礎(chǔ)與臨床安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233000；3.蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院免疫學教研室，安徽 蚌埠 233000；4.蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教研室，安徽 蚌埠 233000

結(jié)核病是全球傳染病致死的主要疾病之一，每年約有1 000 萬人患結(jié)核病，約300 萬人死于肺結(jié)核，結(jié)核病的傳播嚴重危害人們的生命健康［1］。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是結(jié)核病的主要病原體，其與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共同感染的威脅越來越大［2］。近年來，耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)嚴重影響了結(jié)核病的防控，給世界帶來巨大挑戰(zhàn)。目前，唯一可用于結(jié)核病治療的疫苗為牛分枝桿菌減毒疫苗，即卡介苗（bacille de calmette guérin，BCG），但該疫苗在成人中的效力有限，且用于MTB的實驗室診斷方法不敏感，耗時且費力［3］。因此，探索新的MTB 毒力決定因素及其新型藥物靶點，對結(jié)核病的診斷以及疫苗研發(fā)具有積極作用。

PE_PGRS 家族蛋白主要包括 PE 和 PGRS 結(jié)構(gòu)域，PE 結(jié)構(gòu)域位于N?末端且高度保守，PE_PGRS 家族所有成員在PE結(jié)構(gòu)域均含有1個保守的四肽基序DEVS 或 DXXS（X 為任意氨基酸）。PGRS 結(jié)構(gòu)域富含GC 序列，位于PE 結(jié)構(gòu)域之后，極富多態(tài)性且免疫原性較強，GC 序列是一個不完整的短的重復序列，可用于MTB菌株分型；PGRS結(jié)構(gòu)域具有Gly?Gly?Ala和Gly?Gly?X 重復基序（X 為任意氨基酸），是分枝桿菌致病的重要因素［4］。PE_PGRS 蛋白家族主要位于分枝桿菌的細胞壁和細胞膜上，是依賴于ESX?5機制的分泌性蛋白，可被ESX?5 分泌系統(tǒng)運輸和分泌［5］。PE_PGRS35 蛋白（Rv1983）是含558 個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有一個獨特的C?末端結(jié)構(gòu)域，與PE_PGRS16的C?末端結(jié)構(gòu)域具有一定同一性，其在海洋分枝桿菌中的同系物可加工 MTB LipY 蛋白［6］。PE_PGRS35蛋白是一種毒力相關(guān)蛋白，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、相互作用蛋白以及相關(guān)的生物學功能，及其在MTB 中的作用和致病機制均尚不明確。因此，深入探討PE_PGRS35蛋白有助于了解該蛋白在MTB的生長和感染中發(fā)揮的重要作用，這為結(jié)核病疫苗的開發(fā)提供了有效的靶向指標。

本研究利用同源重組克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達載體pET28a?PE_PGRS35，經(jīng)異丙基?β?D半乳糖苷（IPTG）誘導，在大腸埃希菌（E.coli）中表達帶His標簽的MTB H37Rv 菌株P(guān)E_PGRS35 蛋白，經(jīng)親和層析純化后進行生物信息學分析，為進一步鑒定蛋白功能和新型抗結(jié)核藥物疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及DNA 克隆菌株E.coliDH5α，表達菌株E.coliBL21（DE3）和原核表達載體pET28a由蚌埠醫(yī)學院慢性疾病免疫學基礎(chǔ)與臨床安徽省重點實驗室保存；MTB 標準菌株H37Rv 基因組DNA 購自上海晶諾生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 Phanta Max Super?Fidelity DNA Polymerase、同源重組試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA 試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；組氨酸（His）標簽小鼠單克隆抗體、HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 和ECL 底物化學發(fā)光顯色試劑盒、5'?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液均購自碧云天生物科技有限公司；IPTG、苯甲基磺酰氟（PMSF）均購自美國Sigma 公司；Ni?IDA SepharoseCl?6B 親和層析柱購自德國Novagen 公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中H37RvPE_PGRS35基因序列（885921）設(shè)計引物。pET28a?PE_PGRS35正向引物：5'?AAGAAGGAGAT?ATACCATGGGCATGGTGTCATTTCTGGTCGTGGT?3，'pET28a?PE_PGRS35反向引物：5'?TGGTGGTGGTG?GTGCTVGAGCGCCGGATGATCAAAGACTG?3'，擴增片段大小為1 677 bp（全長PCR產(chǎn)物大小為1 719 bp）。引物由上海派森諾生物科技有限公司合成。

1.4 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定 以MTB H37Rv 標準菌株基因組DNA為模板，利用pET28a?PE_PGRS35正反向引物進行 PCR 擴增。50 μL 反應體系：2 ×Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，正、反向引物各1 μL，DNA Max Polymerase 1 μL，基因組DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 2 min，共 40 個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸7 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的基因片段。將表達載體pET28a 經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，30 ℃酶切過夜；膠回收載體片段，按以下反應體系進行同源重組反應：酶切pET28a 1 μL，膠回收目的基因PE_PGRS351 μL，5 × CEBuffer 5 μL，ExnasoMultis 2 μL，ddH2O 12 μL。將10 μL重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至100 μLE.coliDH5α 感受態(tài)細胞中，混勻，冰上靜置30 min；42 ℃熱激90 s，迅速至冰上冷卻2 min；加至900 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖1 h；離心后涂布LB固體培養(yǎng)板（含50 μg／mL 卡那霉素），37 ℃搖床培養(yǎng)過夜；隨機挑取單個陽性菌落進行菌落PCR 鑒定，并送上海派森諾生物科技有限公司測序。選擇測序正確的陽性菌株提取質(zhì)粒，用于后續(xù)試驗。

1.5 重組PE_PGRS35 蛋白的表達 將原核表達載體 pET28a?PE_PGRS35轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）中，挑取單克隆菌落接種至含50 μg／mL 卡那霉素的3 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r／min 搖床振搖培養(yǎng)過夜；進一步擴大培養(yǎng)，按1∶100 比例接種至含50 μg／mL 卡那霉素的30 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r／min 搖床振搖培養(yǎng)；至A600值達 0.6 ~0.8 時，加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol／L，37 ℃誘導過夜；室溫，8 910 ×g離心，棄上清，PBS 重懸菌體沉淀，重懸液經(jīng)超聲破碎后，分別取超聲破碎后上清和沉淀液進行12% SDS?PAGE 分析，考馬斯亮藍染色顯示條帶。

1.6 包涵體溶解及蛋白純化 將菌體沉淀重懸于20 mL裂解緩沖液中（20 mmol／L Tris?HCl，含 1 mmol／L PMSF 和細菌蛋白酶抑制物混合液，pH 8.0），進行超聲破碎（功率400 W，工作4 s，間歇8 s，共20 min）；4 ℃，8 910 ×g離心20 min；收集沉淀，包涵體洗滌液（20 mmol／L Tris，1 mmol／L EDTA，2 mol／L 尿素，1 mol／L NaCl，1%TritonX?100，pH 8.0）洗滌3次，溶解緩沖液（20 mmol／L Tris，5 mmol／L DTT，8 mol／L尿素，pH 8.0）溶解包涵體，4 ℃過夜；室溫，8 910 ×g離心15 min。將PE_PGRS35蛋白滴加至20 mmol／L Tris?HCl，0.15 mol／L NaCl，pH 8.0緩沖液中，倍比稀釋后裝入透析袋，于20 mmol／L Tris?HCl，0.15 mol／L NaCl，pH 8.0緩沖液中透析過夜；將透析后的蛋白上清溶液轉(zhuǎn)移至 Ni?IDA SepharoseCl?6B 親和層析柱中，用 Ni?IDABinding?buffer 沖洗，直至流出液A280值達到基線，用Ni?IDAWashing?buffe（r20 mmol／L Tris?HCl，20 mmol／L 咪唑，0.15 mol／L NaCl，pH 8.0）沖洗，直至流出液A280值達到基線，用Ni?IDAElution?Buffer（20 mmol／L Tris?HCl，20 mmol／L 咪 唑 ，0.15 mol／L NaCl，pH 8.0）洗脫目的蛋白，收集流出液，置含PBS的透析袋中透析過夜后，進行12%SDS?PAGE分析。

1.7 純化的PE_PGRS35 蛋白的鑒定 采用Western blot 法。將純化的變性蛋白經(jīng)12%SDS?PAGE 分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（恒流280 mA，2 h），PBST 洗膜3次，用含5%脫脂奶粉的PBST 搖床封閉5 h；加入His標簽的小鼠單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜；PBST 洗膜3 次，加入HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶1 500 稀釋），室溫孵育2 h；PBST 洗膜3 次，ECL顯影，曝光。

1.8 生物信息學分析 用ExPasy 網(wǎng)站ProParam 工具進行PE_PGRS35 氨基酸理化參數(shù)解析，ExPasy 網(wǎng)站Proscale工具進行親疏水性特征分析，TMHMM2.0工具進行PE_PGRS35 跨膜區(qū)預測，NetPhos3.1 軟件進行磷酸化位點預測，NCBI 數(shù)據(jù)庫中CD?Search 工具進行保守域分析。用SOPMA 軟件進行PE_PGRS35二級結(jié)構(gòu)預測，SWISSMODEL 工具進行三級空間結(jié)構(gòu)分析和模型構(gòu)建。用STRING軟件進行PE_PGRS35相互作用蛋白分析。

2 結(jié)果

2.1 重組表達載體pET28a?PE_PGRS35的鑒定PE_PGRS35基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 677 bp 的特異性片段，大小與理論預測值相符，見圖1。轉(zhuǎn)化后陽性菌落經(jīng)PCR 鑒定，可見1 700 bp（含載體片段170 bp）的特異性條帶，見圖2，表明PE_PGRS35基因已成功轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)DH5α 細胞中。轉(zhuǎn)化后陽性菌落測序結(jié)果與目的基因模板序列一致，表明質(zhì)粒pET28a?PE_PGRS35構(gòu)建正確。

圖1 PE_PGRS35基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of amplification product of PE_PGRS35 gene

圖2 PE_PGRS35基因菌落PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of colony PCR product of PE_PGRS35 gene

2.2 重組 PE_PGRS35 蛋白的鑒定 12%SDS?PAGE分析顯示，在相對分子質(zhì)量約53 000 處可見外源性蛋白表達條帶，與預測的PE_PGRS35 蛋白理論相對分子質(zhì)量（53 730）一致，主要存在于破碎后沉淀中，上清中未見PE_PGRS35蛋白，見圖3。

圖3 表達的PE_PGRS35蛋白的SDS?PAGE分析Fig.3 SDS?PAGE analysis of expressed PE_PGRS35 protein

2.3 純化的PE_PGRS35蛋白的鑒定 12%SDS?PAGE分析顯示，純化的蛋白條帶單一，純度可達90%，未見明顯雜帶，見圖4。Western blot 分析顯示，在相對分子量約53 000 處，誘導后以及誘導破碎后沉淀中可見特異性反應條帶，而pET28a 空載體、誘導前以及誘導破碎后上清中未見明顯條帶，表明PE_PGRS35蛋白在大腸埃希菌中主要以包涵體形式存在，見圖5。

圖4 純化的PE_PGRS35蛋白的SDS?PAGE分析Fig.4 SDS?PAGE analysis of purified PE_PGRS35 protein

圖5 純化的PE_PGRS35蛋白的Western blot分析Fig.5 Western blotting of purified PE_PGRS35 protein

2.4 生物信息學分析

2.4.1 親疏水性特征分析 ProParam 軟件分析結(jié)果顯示，PE_PGRS35 的分子式為 C4765H7855N1677O1980S520，相對分子質(zhì)量約為136 989.03，理論等電點為4.89（屬于酸性蛋白），不穩(wěn)定性指數(shù)為48.30（屬于不穩(wěn)定性蛋白），脂肪系數(shù)為17.11，總平均親水性為0.822，見圖6。

圖6 PE_PGRS35蛋白親水性分析Fig.6 Hydrophilicity analysis of PE_PGRS35 protein

2.4.2 磷酸化位點和保守域分析 NetPhos3.1 軟件預測PE_PGRS35蛋白有39個磷酸化位點，其中絲氨酸位點17 個，蘇氨酸位點15 個，酪氨酸位點7 個，見圖7。CD?Search 工具分析PE_PGRS35蛋白有2個保守結(jié)構(gòu)域，分別為PE 超家族結(jié)構(gòu)域和PE_process_PecA超家族結(jié)構(gòu)域，見圖8。

圖7 PE_PGRS35蛋白磷酸化位點預測Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of PE_PGRS35 protein

圖8 PE_PGRS35蛋白保守域分析Fig.8 Analysis of conserved domains of PE_PGRS35 protein

2.4.3 跨膜區(qū)預測 TMHMM2.0 工具PE_PGRS35無跨膜區(qū)，且預測所有氨基酸位于胞質(zhì)內(nèi)的概率為0.006 19，推測為膜外蛋白，見圖9。

圖9 PE_PGRS35蛋白跨膜區(qū)預測Fig.9 Prediction of transmembrane region of PE_PGRS35 protein

2.4.4 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測 SOPMA 軟件對PE_PGRS35 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，其中α?螺旋（Hh）109個，占19.53%；β?折疊（Ee）157個，占28.14%；β?轉(zhuǎn)角（Tt）40 個，占7.17%；無規(guī)則卷曲（Cc）含量最高，252 個，占45.16%。因此，PE_PGRS35 的主要二級結(jié)構(gòu)形式為β?折疊和無規(guī)則卷曲。SWISSMODEL工具對PE_PGRS35 蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測并構(gòu)建模型，其中有GMQE和QMEAN 兩個模型構(gòu)建質(zhì)量評估指標，GMQE的取值0~1，越靠近1，構(gòu)建的模型越好；QMEAN 得分越接近0，構(gòu)建的模型越成功，而分數(shù)≤-4.0，構(gòu)建模型不可靠。該模型GMQE 評分為0.36，QMEAN評分為0.75。見圖10。

圖10 PE_PGRS35蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.10 Tertiary structure of PE_PGRS35 protein

2.4.5 相互作用蛋白預測 STRING 軟件分析PE?PGRS35 蛋白相互作用的網(wǎng)絡圖見圖11，節(jié)點數(shù)11個，Rv1769、PPE8、PPE64、PPE54、PPE24、PPE16、PPE35、PPE6、PPE28、PE2共10個蛋白與PE?PGRS35蛋白相互作用。

圖11 PE_PGRS35蛋白相互作用蛋白分析Fig.11 Analysis of interacting proteins of PE_PGRS35 pro?tein

3 討論

MTB 是人類結(jié)核病的病原體，仍然是全球范圍內(nèi)的主要致死病原體之一，控制結(jié)核病需要更好地了解MTB逃避免疫系統(tǒng)并在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的機制［7］。結(jié)核病是宿主與病原體及環(huán)境條件相關(guān)的復雜因素相互作用的結(jié)果，活動性結(jié)核病可通過長期的多藥治療方案治愈，但多重耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)仍然是未來結(jié)核病護理的主要障礙［8］。潛伏期是結(jié)核病感染最顯著的特征之一，在該種情況下，MTB與宿主免疫系統(tǒng)建立了動態(tài)平衡，并伴隨患者持續(xù)終生，且不會出現(xiàn)結(jié)核病的跡象及相關(guān)癥狀［9］。PE_PGRS家族成員僅在分枝桿菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，因此對該家族蛋白的進一步研究將有助于了解結(jié)核病的發(fā)病機制和新的預防及治療方法，以便尋找更有效的靶點藥物和新型疫苗［10］。

PE 和PE_PGRS 蛋白家族被認為是海洋分枝桿菌中可能的毒力因子，參與分枝桿菌之間的細胞表面相互作用以及分枝桿菌與巨噬細胞的相互作用［11］。據(jù)文獻報道，經(jīng)MTB基因組測序發(fā)現(xiàn)了PE的多基因家族，占MTB 整個基因組的5%，由36 個同源PE基因和63 個分布在整個基因組中的同源PE_PGRS基因組成，位于PE_PGRS基因N?末端的PE結(jié)構(gòu)域與38個PE基因高度同源，表明這些基因間關(guān)系密切［12?13］。PE_PGRS蛋白家族的表達模式因家族成員和條件的不同而存在較大差異，該家族成員參與抗原變異和免疫逃逸等相關(guān)免疫反應，有助于了解MTB 的生存和發(fā)病機制［14］。已有研究發(fā)現(xiàn)，PE_PGRS33（Rv1818c）在恥垢分枝桿菌的表達可增強其在巨噬細胞和宿主體內(nèi)的持久性，誘導巨噬細胞凋亡和壞死［15］。PE_PGRS42（Rv2487c）被提議作為結(jié)核病診斷和疫苗的候選藥物［16］。PE_PGRS39（Rv2340c）作為一種細胞外蛋白可能直接在宿主?病原體相互作用中發(fā)揮作用且具有引發(fā)免疫反應的潛力，有助于深入了解疫苗的開發(fā)［17］。

PE_PGRS35 蛋白由Rv1983基因編碼，其氨基酸序列保守性很強，是MTB 所特有的性質(zhì)。PE_PGRS35 是一種含588 個氨基酸的蛋白質(zhì)，含有1 個獨特的C?末端結(jié)構(gòu)域［6］。BURGGRAAF 等［18］研究表明，PE_PGRS35 在海洋分枝桿菌中表達為異源蛋白時，其在海洋分枝桿菌中的同系物可以加工MTB 蛋白LipY（LipYtub），PE_PGRS35蛋白對來自海洋分枝桿菌和潛在MTB 的PE_PGRS 蛋白具有蛋白水解活性，被認為在免疫調(diào)節(jié)、巨噬細胞侵襲和B 細胞反應中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，將PE_PGRS35重組載體轉(zhuǎn)染至HeLa和HEK293上皮細胞中均可被強烈表達，與PE_PGRS14、PE_PGRS24等7個基因共屬于組成型表達［19］。PE_PGRS35 是在感染牛和接種BCG 的牛中被識別的一種抗原，有56%的結(jié)核病患者對PE_PGRS35 中至少一種肽有陽性反應，結(jié)核病患者會優(yōu)先識別 PE_PGRS35?P4、P6?P13 和 P24 區(qū)域，已有研究數(shù)據(jù)表明，這些表位在結(jié)核病的免疫學診斷中可能具有潛在的診斷價值［20］。PE_PGRS35蛋白是RD2 區(qū)的蛋白，在MTB 毒株中保守存在。GROVER 等［2］推測，PE_PGRS 家族成員在肺泡中形成空泡的過程是通過影響肉芽組織或維持刺激腫瘤壞死因子的方式實現(xiàn)的。盡管如此，PE_PGRS35 蛋白如何在結(jié)核病發(fā)病中起作用，以及其功能和生物學作用尚不明確，有待進一步探討。

本研究擴增了PE_PGRS35編碼基因，并利用同源重組技術(shù)將其克隆至pET28a載體，經(jīng)DNA 測序分析，測序結(jié)果與預期基因序列相一致，表明重組質(zhì)粒pET28a?PE_PGRS35構(gòu)建成功。SDS?PAGE 分析顯示，誘導的重組菌在相對分子量約53 000 處可見明顯條帶，大小與預期結(jié)果相一致，并經(jīng)Western blot分析，表達的PE_PGRS35 蛋白以包涵體的形式存在，且具有良好的反應原性。這與很多MTB 蛋白類似［21?22］。此外，本研究對包涵體蛋白進行了溶解和純化，獲得純度較高的變性蛋白，后續(xù)也將嘗試用純化后的PE_PGRS35 蛋白制備多克隆抗體。本研究在PE_PGRS35 的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)等方面進行了生物信息學分析。PE_PGRS35 的等電點為4.89，不穩(wěn)定指數(shù)為48.30，屬于酸性不穩(wěn)定性蛋白。在線軟件TMHMM 預測PE_PGRS35 蛋白無跨膜區(qū)，且預測所有氨基酸位于胞質(zhì)內(nèi)的概率為0.006 19，推測為膜外蛋白。MAWUENYEGA 等［23］分析了 MTB 中上千種蛋白的亞細胞定位，證明PE_PGRS35蛋白定位于細胞壁上，這與WOLFPSORT 軟件分析結(jié)果一致，表明PE_PGRS35 蛋白可能在MTB 與宿主細胞之間發(fā)揮著相互作用。其二級結(jié)構(gòu)主要為β?折疊和無規(guī)則卷曲，占73.3%；PE_PGRS35 含39 個磷酸化位點，無規(guī)則卷曲占45.16%，表明其易與抗體嵌合。CHEN等［24］發(fā)現(xiàn)，95%的 PE?PPE 蛋白對與ESX?5 分泌系統(tǒng)分泌的EspG5相互作用從而形成晶體結(jié)構(gòu)，同時闡明了PE?PPE 蛋白對結(jié)合特異性的分子基礎(chǔ)，從而有利于結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮免疫效應。WILLIAMSON 等［25］提出來自 ESX?3 系統(tǒng)的 PE5mt?PPE4mt?EspG3mm的異三聚體的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了EspG3mm以類似于EspG5的方式專門與PPE4mt相互作用。根據(jù)對PE_PGRS35蛋白的相互作用蛋白的分析，由此可以推測PE_PGRS35 蛋白也能與其相互作用蛋白構(gòu)成PE?PPE 結(jié)合對，從而與EspG5相互作用，發(fā)揮其對機體的免疫效應。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pET28a?PE_PGRS35表達載體，經(jīng)IPTG 誘導表達了PE_PGRS35 蛋白，該蛋白以包涵體形式存在，純度較高，并利用在線軟件對其進行了生物信息學分析。本研究在結(jié)核病的診斷、治療和疫苗開發(fā)方面均具有潛在的價值，有利于控制結(jié)核病的傳播及流行。