張思淼,薛琳琳,周文凱,胡惠潔,徐 彬,郭景茹*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150111)

我國寒冷地區(qū)覆蓋面積遼闊，冬季寒冷漫長，降雪量大，溫度一直維持在較低的水平，例如我國東北、華北、西北等地區(qū)的冬季和高緯度地區(qū)的環(huán)境溫度可以達(dá)到0℃之下，少數(shù)地區(qū)可達(dá)到-30℃之下，據(jù)查全國各個地區(qū)80%的畜禽養(yǎng)殖場畜舍都是開放式或半開放式，因而目前在我國的大部分寒冷地區(qū)都可能面臨畜禽處于冷暴露環(huán)境的威脅。冷暴露對畜禽養(yǎng)殖造成了許多不利影響，如采食量增加、基礎(chǔ)代謝率增加、能量損失增加、動物免疫力降低等[1]造成畜禽生產(chǎn)性能下降，給畜牧行業(yè)帶來了巨大的損失。若對畜禽的防護(hù)措施欠妥或者不及時，致使畜禽長期處于冷暴露環(huán)境中，可引起機(jī)體氧化，增加自由基含量，對動物機(jī)體內(nèi)臟器造成損傷，例如肺水腫、肝水腫、腸道出血等，并且誘導(dǎo)生理學(xué)、行為學(xué)和免疫學(xué)的變化[2]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在-20℃ 的環(huán)境冷暴露5 min就會導(dǎo)致肝臟水腫；大鼠-8℃冷暴露4 h會耗盡肝臟糖原，造成肝臟損傷；冷暴露后雛雞十二指腸出現(xiàn)不同程度的充血和出血[3-5]。而腸道是保護(hù)機(jī)體的第一道防線。腸道分為十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸，其中結(jié)腸可以吸收水、Na+、Cl-和短鏈脂肪酸，分解K+和碳?xì)浠衔?，保持機(jī)體水分平衡從而防止機(jī)體脫水，而且結(jié)腸中具有種類豐富的微生物，這些微生物可以防止致病菌的定植和生長[6]。結(jié)腸存在著四大屏障：機(jī)械、化學(xué)、生物和免疫屏障，其中機(jī)械屏障主要是由黏液層、結(jié)腸上皮細(xì)胞和緊密連接等構(gòu)成。結(jié)腸上皮細(xì)胞作為機(jī)械屏障的主要結(jié)構(gòu)之一，其直接與大量微生物和有毒物質(zhì)等持續(xù)接觸，大量研究結(jié)果表明，結(jié)腸的機(jī)械屏障功能與多種腸道疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，例如克羅恩病，克羅恩病患者的腸道與健康腸道相比通透性明顯增加[7]。而緊密連接是由跨膜蛋白、支架蛋白和調(diào)節(jié)分子組成的復(fù)合物[8]，其對維持機(jī)械屏障的完整性和腸上皮正常生理功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。緊密連接通過調(diào)節(jié)水、離子和其他溶質(zhì)的通過來控制細(xì)胞旁通透性，還可通過阻斷基底外側(cè)膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的自由擴(kuò)散，從而維持細(xì)胞極性[9]。緊密連接被破壞會間接引起致病菌和內(nèi)毒素的移位，繼而導(dǎo)致腸道屏障功能受損[10]。因為結(jié)腸上皮細(xì)胞的緊密連接可抑制細(xì)菌黏附、防止腸源性感染，所以結(jié)腸上皮細(xì)胞的緊密連接對畜禽腸道健康極其重要，且根據(jù)腸道解剖學(xué)特點(diǎn)可知，腸道很容易受到冷暴露的影響，目前關(guān)于慢性冷暴露對小鼠結(jié)腸的影響報道較少。本試驗采用了蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察冷暴露后小鼠結(jié)腸形態(tài)學(xué)的變化，利用免疫熒光技術(shù)觀察冷暴露后小鼠結(jié)腸組織中帶狀閉合蛋白-1(ZO-1)的定位情況和應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blot)分別檢測了冷暴露后小鼠結(jié)腸組織中緊密連接相關(guān)蛋白中閉合蛋白-1(Claudin-1)、咬合蛋白(Occludin)、ZO-1和炎癥因子中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)情況，以探究慢性冷暴露對小鼠結(jié)腸緊密連接的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物與分組5周齡C57BL/6雄性小鼠(體質(zhì)量為22～24 g)在人工智能氣候室中(24±2)℃，40%相對濕度，明/暗：12/12 h自由飲水進(jìn)食。預(yù)飼1周后的小鼠隨機(jī)分為對照組和冷暴露組。冷暴露組的小鼠置于4℃、濕度為40%的環(huán)境中每天暴露3 h，連續(xù)刺激3周，其余時間置于室溫環(huán)境。對照組小鼠始終置于室溫環(huán)境中飼養(yǎng)。在冷暴露周期結(jié)束后，根據(jù)試驗要求對2組動物安樂死后再將小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行分離和采集，用于后續(xù)試驗。

1.2 主要儀器人工智能氣候室購于濟(jì)南徐邦電子科技有限公司；電泳槽、轉(zhuǎn)印儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于Bio-Rad；脫色搖床購于中國其林貝爾公司；酶標(biāo)儀購于邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司；激光共聚焦顯微鏡、冰凍切片機(jī)購于Leica。

1.3 主要試劑BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試盒、多聚甲醛購于碧云天生物技術(shù)有限公司；ZO-1、Claudin-1、Occludin、IL-1β、iNOS、TNF-α一抗、HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗、CoraLite488偶聯(lián)的ZO-1多克隆抗體、羊抗兔綠色熒光二抗購于Proteintech。

1.4 HE染色取約1 cm新鮮結(jié)腸組織，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片、烘干、染色、蓋片和封片等步驟制作切片，最后使用顯微鏡進(jìn)行觀察小鼠結(jié)腸組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 免疫熒光染色將對照組和冷暴露組小鼠的結(jié)腸組織利用4%多聚甲醛固定，制備組織切片后，使用封閉液進(jìn)行封閉。一抗二抗避光孵育后封邊，最后利用激光共聚焦顯微鏡檢測ZO-1在結(jié)腸組織中的表達(dá)和定位。其中綠色熒光為ZO-1蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。

1.6 Western blot將小鼠結(jié)腸組織研磨提取總蛋白，計算蛋白濃度。準(zhǔn)備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照說明書配制分離膠和濃縮膠。組裝電泳槽，將蛋白樣品加入各孔，連接電泳儀器，常規(guī)電壓50 V/30 min、80 V/30 min、120 V/30 min。根據(jù)所需要的目的條帶分子質(zhì)量切膠，裁剪匹配膠的PVDF膜，將“三明治”放在電轉(zhuǎn)槽中，設(shè)置恒流250 mA，進(jìn)行電轉(zhuǎn)。用5%脫脂奶粉配制的封閉液對PVDF膜進(jìn)行1 h的封閉。再用下列一抗孵育過夜：ZO-1、Claudin-1、Occludin、IL-1β、iNOS、TNF-α，β-actin作為內(nèi)參。用洗滌緩沖液洗膜4次，根據(jù)蛋白說明書用1XTBST配置二抗，室溫孵育1 h，用洗滌緩沖液洗膜4次。按照說明書配置顯影液，先打開機(jī)器預(yù)熱，將PVDF膜放入ChemiDocXRS+機(jī)器中，將顯影液滴到PVDF膜上進(jìn)行顯影。使用Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織HE染色結(jié)果如圖1所示，HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比冷暴露組皺襞消失。

A.對照組；B.冷暴露組

2.2 慢性冷暴露對小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)量的影響如圖2所示，與對照組相比冷暴露組緊密連接蛋白表達(dá)降低，其中Occludin顯著下調(diào)(P<0.05)，Claudin-1和ZO-1呈現(xiàn)較低水平，且差異極顯著(P<0.01，P<0.001)。

A.對照組與冷暴露組Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)量Western blot檢測結(jié)果； B.Claudin-1的表達(dá)變化；C.Occludin的表達(dá)變化；D.ZO-1的表達(dá)變化；*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.3 結(jié)腸組織ZO-1免疫熒光染色結(jié)果如圖3所示，免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比冷暴露組ZO-1含量較少，分布松散。

圖3 免疫熒光檢測對照組和冷暴露組小鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)

2.4 慢性冷暴露對小鼠結(jié)腸炎癥因子表達(dá)量的影響如圖4所示，與對照組相比，冷暴露組小鼠的結(jié)腸炎癥因子表達(dá)升高，其中iNOS和TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，IL-1β的表達(dá)呈升高趨勢，且差異極顯著(P<0.01)。

A.對照組與冷暴露組TNF-α、IL-1β和iNOS表達(dá)量Western blot檢測結(jié)果； B.TNF-α的表達(dá)變化；C.IL-1β的表達(dá)變化；D.iNOS的表達(dá)變化

3 討論

冷暴露是我國常見的影響畜禽生長的環(huán)境因素之一。動物受冷暴露后機(jī)體的反應(yīng)機(jī)理十分復(fù)雜。當(dāng)畜禽持續(xù)處于冷暴露環(huán)境中，機(jī)體腎上腺皮質(zhì)激素和兒茶酚胺增多，促進(jìn)機(jī)體代謝，提高機(jī)體適應(yīng)能力；長期處于冷暴露環(huán)境中，能量不斷被消耗，部分機(jī)能被破壞，適應(yīng)能力和抵抗能力下降，引起內(nèi)環(huán)境失調(diào)，會損傷許多內(nèi)臟器官，最后機(jī)體衰竭[11]。慢性冷暴露影響畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，還對動物機(jī)體的健康和福利造成不良影響。故我們?yōu)樘骄坷浔┞秾π∈蠼Y(jié)腸的影響，對慢性冷暴露后小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化進(jìn)行研究。

雖然皮膚與外界環(huán)境接觸最直接，但是黏膜聯(lián)合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于皮膚。腸道的黏膜面積最大，與食糜、抗原和各種微生物持續(xù)接觸，且結(jié)腸中富含多種微生物。因此，結(jié)腸是先天免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵部位。腸道皺襞增大的表面積，有利于腸道益生菌的的定植[12]。本試驗HE染色顯示與對照組相比冷暴露組小鼠結(jié)腸皺襞消失。這提示了冷暴露對小鼠結(jié)腸產(chǎn)生顯著的影響，表面積減少可能會降低益生菌的定植，進(jìn)而影響結(jié)腸的免疫屏障功能。研究表明，損傷緊密連接的結(jié)構(gòu)完整性和功能會引發(fā)腸壁通透性增高，引發(fā)結(jié)腸炎的發(fā)生[13]。緊密連接封閉了細(xì)胞間隙，在腸道內(nèi)的位置不同緊密連接對小分子通透能力有所不同[8]。緊密連接相關(guān)蛋白包括Claudin、Occludin、ZO蛋白家族等，Claudin蛋白家族是構(gòu)成緊密連接，維持細(xì)胞之間連接并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子流動所必需的蛋白之一；Occludin蛋白家族是膜蛋白的重要組成部分，主要參與腸壁通透性的調(diào)節(jié)；ZO蛋白與其他蛋白，如肌動蛋白及其相關(guān)蛋白相互作用形成一個堅實(shí)的框架以維持膜的完整性。研究表明，當(dāng)ZO-1受損時或Occludin蛋白被水解，緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞旁途徑通透性增高[14-16]。在本試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在冷暴露處理后小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1、Occludin、ZO-1的表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著下調(diào)，并且細(xì)胞間的緊密連接蛋白ZO-1結(jié)構(gòu)被破壞、含量較少且分散分布。這些結(jié)果表明慢性冷暴露會導(dǎo)致小鼠結(jié)腸緊密連接受損，從而引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)一系列的異常反應(yīng)，形態(tài)上的變化皺襞消失。有研究表明，緊密連接受損，嚴(yán)重時還會引發(fā)細(xì)胞凋亡等[17]。

研究表明TNF-α是腸上皮屏障損傷的重要啟動因子，TNF-α抑制ZO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄和Occludin啟動子的表達(dá)，降低ZO-1和Occludin的表達(dá)，破壞腸道緊密連接的完整性使腸壁通透性增加[18-19]。推測緊密連接受損是否與炎癥因子存在密切關(guān)系，采用Western blot技術(shù)進(jìn)一步檢測炎癥因子TNF-α的表達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比冷暴露組小鼠結(jié)腸TNF-α的表達(dá)量顯著上調(diào)。而在MLCK途徑中，TNF-α與腸上皮細(xì)胞表面腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)結(jié)合后，激活NF-κB進(jìn)而增加IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)IL-1β和TNF-α的表達(dá)，而炎癥因子表達(dá)增加通過正反饋再次激活NF-κB，進(jìn)一步加重腸道緊密連接的損傷[20]。隨后本研究繼續(xù)利用Western blot技術(shù)檢測IL-1β的表達(dá)，試驗結(jié)果顯示與對照組相比冷暴露組小鼠結(jié)腸中IL-1β的表達(dá)量顯著上調(diào)。同時有研究表明，IL-1β可導(dǎo)致腸上皮緊密連接通透性增加；IL-1β引起Caco-2跨膜電阻的時間依賴性下降[21]。而IL-1β可以誘導(dǎo)iNOS mRNA和NO的產(chǎn)生[22]。本研究又檢測了iNOS的表達(dá)，與對照組相比冷暴露組小鼠結(jié)腸中iNOS顯著上調(diào)。研究表明iNOS表達(dá)量增加可以促進(jìn)NO的產(chǎn)生，NO通過影響緊密連接蛋白表達(dá)的細(xì)胞信號進(jìn)而損傷腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，增加腸壁通透性[23-24]。腸道受損時，就會激發(fā)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌大量炎癥因子，這些細(xì)胞因子作用于細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)上，破壞緊密連接蛋白，進(jìn)而破壞腸道機(jī)械屏障，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[25]。試驗結(jié)果表明了腸道緊密連接與腸道炎癥存在著密切關(guān)系，結(jié)腸是腸道中菌群最密集豐富的腸段，且慢性冷暴露后結(jié)腸的緊密連接受損，可能導(dǎo)致致病菌更容易侵入機(jī)體。

綜上所述，本試驗探究了慢性冷暴露對小鼠結(jié)腸緊密連接的影響，證明了慢性冷暴露會引發(fā)緊密連接受損，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而關(guān)于慢性冷暴露對小鼠結(jié)腸緊密連接的影響的機(jī)制、緊密連接受損和炎癥反應(yīng)發(fā)生的順序以及通過保證腸道緊密連接的完整性預(yù)防腸道疾病的方法仍需要進(jìn)一步深入研究。