謝佳雨,戴隆超,王娜,劉成,王令充

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院,上海 200062)

氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)是動物藥中的主要成分,其中大多數(shù)還被現(xiàn)代研究證實是動物藥的特效成分[2]。目前已經(jīng)從土鱉蟲中分離出多種活性多肽及蛋白成分,這些成分具有較強的抗腫瘤[3]、抗凝血/抗血栓形成[4-5]、抗氧化[6-7]、降血脂[8-9]、護肝[10-11]與免疫調(diào)節(jié)[12-13]等活性。土鱉蟲多肽及蛋白類成分的研究難點聚焦于分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，由于其過低的分離率與多樣化的組成成分,導(dǎo)致對土鱉蟲大分子成分的結(jié)構(gòu)與功能認識嚴重缺乏。為此需要進一步發(fā)現(xiàn)功能性土鱉蟲大分子類成分及其藥理藥效的作用機制。

1 材料

土鱉蟲藥材購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬舟山中醫(yī)院藥房,經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)普陀醫(yī)院劉成研究員鑒定為中藥土鱉蟲EupolyphagasinensisWalker雌蟲干燥體。正常人肝細胞株L-02、肝星狀細胞HSC-T6、肝癌細胞株SMMC-7721(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫);胎牛血清(ABW,批號:AB-FBS0500);TGF-β(Perprotech,批號:100-21);BCA試劑盒(南京建成,批號:A045-4-2);Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(南京建成,批號:G003-1);Cellulose DEAE-52(北京索萊寶,批號:20180308);葡聚糖凝膠G-100(上海源葉,批號:2110G100L12);色譜級乙腈(Tedia,批號:22075171);色譜級甲醇(Tedia,批號:22065054)。其他市售化學(xué)品和試劑均為分析級。

蛋白純化儀AKTA Purifier 95(PekinElmer,型號:Envision);LC-MS/MS(Thermo Fisher,型號:Q Exactive);高效液相色譜儀(Waters,型號:e2695);倒置熒光顯微鏡(Nikon,型號:Eclip SE Ti-S);倒置顯微鏡(Olympus,型號:CKX-31)。

2 方法

2.1 土鱉蟲活性粗蛋白的提取及分離

干燥土鱉蟲打粉,加入10倍體積量的20%乙醇,60～75 ℃回流提取2次,每次1 h,合并提取液,減壓濃縮(60 ℃)至3倍物料質(zhì)量的體積,6 000 r·min-1離心15 min,收集上清液,冷凍干燥可得EE粉末,使用前-20 ℃避光存儲。

將65.19 g EE粉末溶解于30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中,將硫酸銨添加到溶液中至飽和狀態(tài),攪拌1 h后靜置3 h,10 000 r·min-1離心20 min,收集沉淀復(fù)溶后透析36 h以脫除鹽分,冷凍干燥可得27.59 g粗蛋白樣品EEP。

將粗蛋白EEP粉末復(fù)溶在30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中,并先后使用截留分子量為10 kDa與3 kDa的超濾離心管連續(xù)2次離心(6 660 r·min-1,15 min)分離操作,可按照分子量將EEP溶液分為3個蛋白部位截留液,分別收集并冷凍干燥,命名為EEPA(<3 kDa)、EEPB(3～10 kDa)及EEPC(>10 kDa)。

2.2 土鱉蟲蛋白分離物對L-02、SMMC-7721細胞增殖影響

L-02細胞、SMMC-7721細胞接種于含10%FBS、1%青-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基中,置5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將對數(shù)生長期L-02細胞接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1),接種24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入不同濃度的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)24 h,加入MTT溶液(5 mg·mL-1,每孔20 μL),避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清,每孔再加入150 μL DMSO,震蕩10 min待結(jié)晶物溶解后,在酶標儀490 nm處讀取吸光值(A),考察土鱉蟲提取物在規(guī)定濃度范圍內(nèi)是否影響正常肝細胞L-02增殖與存活。細胞活力由下式計算:細胞活力=A實驗組/A空白對照組×100%。IC50值是從細胞活力對藥物濃度的反應(yīng)曲線推導(dǎo)出來的。

將對數(shù)生長期肝癌細胞SMMC-7721接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1),采用上述MTT方法測定不同濃度的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)對肝腫瘤細胞SMMC-7721細胞活力的影響。

2.3 土鱉蟲蛋白分離物對活化的HSC-T6細胞增殖影響

HSC-T6的培養(yǎng)條件如2.2所述。將對數(shù)生長期肝星狀細胞HSC-T6接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1),采用上述MTT方法測定不同濃度的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)對正常HSC-T6細胞活力的影響。

取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞,接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1)。實驗分為空白組、模型組和土鱉蟲各樣品實驗組,每組設(shè)6個復(fù)孔。除空白組外,各組細胞均添加細胞因子TGF-β(10 ng·mL-1)培養(yǎng)24 h用于激活HSC-T6細胞,此后細胞棄去上清,空白組添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),實驗組添加在無毒濃度范圍之內(nèi)的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)進行孵育24 h。采用MTT法測定各組細胞活力。

2.4 土鱉蟲活性蛋白部位EEPC的分離純化

采用AKTA Purifier 95中壓色譜系統(tǒng)按照離子交換和凝膠滲透原理對EEPC進行分離純化[20]。首先進行DEAE-52 Cellulos陰離子柱層析(1.6 cm×20 cm)分離,EEPC溶解在30 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)中進樣,用不同濃度(0～1.0 mol·L-1)NaCl進行梯度洗脫,流速1 mL·min-1,280 nm檢測洗脫液餾分吸光度值,繪制EEPC的DEAE洗脫圖譜,并對峰面積積分,計算各峰占比。

收集EEPC在DEAE柱層析上分離的主要餾分PC3,在Sephadex G-100層析柱(1.6 cm×40 cm)上進一步純化,洗脫溶液為30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 8.0),流速0.75 mL·min-1,280 nm檢測洗脫液餾分吸光度值,繪制EEPC的主要餾分PC3的Sephadex G-100洗脫圖譜,并對峰面積積分,計算各峰占比。根據(jù)相對含量收集主要產(chǎn)物PC3-Ⅲ樣品,凍干保存用于后續(xù)實驗。

2.5 土鱉蟲分離蛋白PC3-Ⅲ的體外抗腫瘤與肝纖維化活性評價

將樣品PC3-Ⅲ按照一定的濃度分別與L-02及SMMC-7721細胞共同孵育,按照2.2中所述方法研究PC3-Ⅲ樣品對SMMC-7721體外增殖(MTT法)的影響,并將結(jié)果和EEPC進行對比。

使用Hoechst33342染色觀察EEPC與PC3-Ⅲ處理后SMMC-7721細胞凋亡情況。將SMMC-7712接種到24孔板中(500 μL,1.6×105mL-1),24 h后棄培養(yǎng)基給藥(EEPC與PC3-Ⅲ)。給藥48 h后棄去培養(yǎng)基,加入200 μL 4%多聚甲醛孵育15 min。孵育結(jié)束后棄去多聚甲醛,加入200 μL質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的Hoechst33342染料,37 ℃避光孵育30 min后置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

采用流式細胞術(shù)檢測EEPC與PC3-Ⅲ處理后SMMC-7721細胞凋亡情況。將SMMC-7712接種到6孔板中(2 mL,2.5×105mL-1),按照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書操作。

采用劃痕實驗考查EEPC與PC3-Ⅲ對SMMC-7721細胞遷移作用的影響,將SMMC-7712接種于12孔培養(yǎng)板(1 mL,1.5×105mL-1),長滿后用槍頭劃痕,隨后給藥并在0、24、48 h于倒置顯微鏡下(低倍鏡)拍照,最后用Image J軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

將樣品PC3-Ⅲ按照一定的濃度分別與正常的HSC-T6細胞及受到TGF-β激活的HSC-T6共同孵育,按照2.3中所述方法研究PC3-Ⅲ樣品對HSC-T6激活后的體外增殖(MTT法)的影響,并將結(jié)果和EEPC樣品進行對比。

2.6 土鱉蟲活性蛋白PC3-Ⅲ的化學(xué)表征

使用BCA試劑盒對PC3-Ⅲ進行含量測定。使用分離膠濃度為12%的預(yù)制膠對樣品PC3-Ⅲ進行SDS-PAGE分析。

利用Waters e2695高效液相色譜儀及漢邦MEGRESS C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)柱對PC3-Ⅲ進行HPLC分析。洗脫溶劑系統(tǒng)是水-三氟乙酸(TFA)(溶劑A 100∶0.1,v/v)和乙腈(溶劑B)。0～30 min,溶劑B從0～20%進行梯度洗脫,流速1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm。

利用LC-MS/MS對PC3-Ⅲ的鑒定由上海中科新生命分析服務(wù)部進行。PC3-Ⅲ經(jīng)過還原和烷基化處理后,加入Trypsin(質(zhì)量比1∶50),在37 ℃條件下酶解20 h。酶解產(chǎn)物脫鹽后凍干,復(fù)溶于0.1%甲酸溶液中,-20 ℃保存待用。采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy-nLC進行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡,樣品由自動進樣器上樣到上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18),經(jīng)過分析柱(Thermo scientific EASY column,10 cm×75 μm,3 μm,C18-A2)分離,流速為300 nL·min-1。0～50 min,B液線性梯度從0～60%;50～54 min,B液線性梯度從60%～90%;54～60 min,B液維持在90%。樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。檢測方式為正離子,母離子掃描范圍m/z300～1 800,一級質(zhì)譜分辨率為70 000(m/z200),最大增益控制(AGC Target)為1×106,一級最大進樣時間(Maximum IT)為40 ms,掃描范圍數(shù)(Number of scan ranges)為1,動態(tài)排除(Dynamic exclusion)為30.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描(Full scan)后采集20個碎片圖譜(MS2 scan),MS2解離模式(MS2 Activation type)為高能碰撞解離(HCD),隔離窗口(Isolation window)為m/z2,二級質(zhì)譜分辨率17 500(m/z200),微碎片圖譜數(shù)(Microscans)為1,二級Maximum IT為50 ms,歸一化碰撞能量(Normalized collision energy)為27 eV,填充率(Underfill ratio)為0.1%。質(zhì)譜測試原始文件(Raw file)用Mascot2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(uniprot_Corydiidae_385_20220425),搜庫條件:Enzyme為Trypsin,固定修飾(Fixed modifications)選擇為Carbamidomethyl(C)修飾,不完全酶解位點數(shù)(Missed cleavages)為2個,物種來源(Taxonomy)為鱉蠊科(Corydiidae),肽質(zhì)量誤差(Mass tolerance)為0.1 Da,肽段篩選的最低分為20。經(jīng)檢索后得到鑒定結(jié)果。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結(jié)果

3.1 土鱉蟲的提取分離與粗蛋白產(chǎn)物制備

65.19 g EE鹽析后得到27.59 g粗蛋白EEP,得率為18.47%。EEP為無氣味黃褐色絮狀物質(zhì)。12.21 g EEP復(fù)溶后經(jīng)超濾分離得到1.28 g EEPA,1.71 g EEPB和8.50 g EEPC,得率分別為10.79%、12.50%、72.32%。EEPA、EEPB、EEPC均為絮狀物質(zhì),顏色由淺到深,分別為淡黃色、黃色和黃褐色。

3.2 土鱉蟲蛋白分離物對SMMC-7721細胞增殖影響

從圖1中可以看出,在0～2 mg·mL-1的濃度范圍之內(nèi),5種土鱉蟲產(chǎn)物EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC均對正常肝細胞無毒,因此后續(xù)實驗濃度選在此范圍內(nèi)。EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC均能以濃度依賴性方式抑制肝腫瘤細胞SMMC-7721的增殖。EE、EEPA對SMMC-7721的IC50值分別>2 mg·mL-1、>1 mg·mL-1;EEP、EEPB及EEPC對SMMC-7721的IC50值分別為1、0.93、0.67 mg·mL-1。EE的IC50值大于EEP,說明經(jīng)鹽析分離得到的粗蛋白樣品EEP是土鱉蟲主要的抗腫瘤活性成分。而EEP經(jīng)超濾分離得到的3個樣品中,分子量最大的EEPC具有更強的抗SMMC-7721增殖作用,說明EEPC在體外具有潛在的抗肝癌作用。

注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.3 土鱉蟲蛋白分離物對活化的HSC-T6細胞增殖的影響

從圖2中可以看出,在0～2 mg·mL-1的濃度范圍之內(nèi),5種土鱉蟲產(chǎn)物EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC均對正常HSC-T6細胞無毒性作用,因此后續(xù)實驗濃度在此范圍內(nèi)。與空白對照組相比,模型對照組加入TGF-β后顯著刺激了HSC-T6細胞的生長(P<0.01),說明造模成功。與模型對照組相比,EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC都一定程度上抑制了激活后HSC-T6細胞活力。樣品EE及EEP考察濃度范圍為0～2 mg·mL-1,樣品EEPA、EEPB及EEPC作用濃度范圍為0～1 mg·mL-1。EE在考察濃度范圍內(nèi)對HSC-T6細胞活力無顯著性影響,EEP能顯著抑制活化HSC-T6細胞生長(P<0.05,P<0.01),且具有一定的濃度依賴性。說明經(jīng)鹽析分離得到的粗蛋白樣品EEP是土鱉蟲主要的抑制纖維化活性成分。樣品EEP的分離物EEPA、EEPB及EEPC各濃度組都能顯著抑制激活后HSC-T6細胞生長(P<0.05,P<0.01),而其中活性最強的是EEPC樣品。由此可見EEP及EEPC可延緩肝纖維化的形成,并且EEPC是EEP發(fā)揮抑制肝纖維化進程的主要活性部位。

注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.4 土鱉蟲活性蛋白PC3-Ⅲ的分離純化

將活性強的EEPC進行下一步純化。經(jīng)DEAE陰離子層析將其分為6個組分(圖3A),分別命名為PC1～6。收集其豐量組分PC3(圖3B),經(jīng)Sephadex G-100層析后,分為3個組分(圖3C),分別命名為PC3-Ⅰ～Ⅲ,收集其豐量組分PC3-Ⅲ(圖3D)并冷凍干燥,最終得到蛋白PC3-Ⅲ。

注:A.EEPC陰離子交換色譜洗脫曲線;B.EEPC經(jīng)DEAE洗脫所得6組分峰面積定量分析; C.PC3凝膠過濾色譜洗脫曲線;D.PC3經(jīng)Sephadex G-100洗脫所得3組分峰面積定量分析

3.5 PC3-Ⅲ對SMMC-7721細胞增殖的影響

PC3-Ⅲ是EEPC的主要成分,為了研究PC3-Ⅲ是否對肝癌細胞具有抗增殖作用,MTT法檢測了PC3-Ⅲ處理后SMMC-7721的細胞活力。如圖4所示,PC3-Ⅲ在0～2 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)對正常肝細胞L-02無毒。PC3-Ⅲ在0～1 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)都能顯著抑制腫瘤細胞SMMC-7721的增殖(P<0.01)，IC50值為0.88 mg·mL-1。說明PC3-Ⅲ在體外具有潛在的抗肝癌作用,并且是EEPC的主要活性部位。

注:與空白對照組比較,**P<0.01。

3.6 EEPC與PC3-Ⅲ誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡

如圖5所示,空白對照組細胞核染色均勻,不同濃度EEPC及PC3-Ⅲ給藥組細胞核固縮,染色質(zhì)凝聚,并有凋亡小體形成和熒光強度增強。說明EEPC及PC3-Ⅲ能夠誘導(dǎo)SMMC-7721細胞的凋亡。如圖6所示,與空白對照組相比,不同濃度EEPC及PC3-Ⅲ處理SMMC-7721細胞后,細胞的凋亡比例明顯增高(P<0.05,P<0.01),且呈濃度依賴性。說明了EEPC及PC3-Ⅲ是通過誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡來抑制其惡性增殖,從而發(fā)揮抗腫瘤活性。

圖5 EEPC及PC3-Ⅲ誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

注：與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.7 EEPC與PC3-Ⅲ抑制SMMC-7721細胞遷移

采用劃痕試驗觀察EEPC與PC3-Ⅲ對SMMC-7721遷移的影響?？瞻讓φ战M細胞在48 h后遷移填充劃痕區(qū)域,而EEPC與PC3-Ⅲ在0.25、0.5、1 mg·mL-1濃度下均顯著抑制SMMC-7721的遷移。說明EEPC及PC3-Ⅲ也能通過抑制腫瘤細胞遷移來發(fā)揮抗肝癌作用(圖7)。

圖7 EEPC及PC3-Ⅲ處理不同時間后SMMC-7721細胞遷移情況

3.8 PC3-Ⅲ對活化的HSC-T6細胞增殖的影響

通過考察PC3-Ⅲ在體外對活化的HSC-T6細胞增殖影響來判斷其體外抑制肝纖維化的作用。如圖8所示，在0～2 mg·mL-1的濃度范圍之內(nèi),PC3-Ⅲ對正常HSC-T6細胞無毒,因此后續(xù)實驗濃度選在此范圍內(nèi)。PC3-Ⅲ在不同濃度下均能顯著抑制TGF-β激活后的HSC-T6細胞增殖(P<0.01),且具有劑量依賴性。表明PC3-Ⅲ具有延緩肝纖維化進程的作用,是EEPC中發(fā)揮延緩肝纖維化進程的主要成分。

注:與模型對照組比較,**P<0.01。

3.9 PC3-Ⅲ蛋白的表征

EEPC里面的主要活性成分為PC3-Ⅲ,其得率為71.89%,因此對其進行了部分理化表征。BCA試劑盒法測得PC3-Ⅲ的蛋白含量為(96.48±2.64)%。RP-HPLC的結(jié)果(圖9A)顯示1個純度超過97%的對稱峰,表明PC3-Ⅲ是均一蛋白;PC3-Ⅲ在SDS-PAGE中出現(xiàn)單條帶(圖9B),分子量約為10 kDa。我們采用LC-MS/MS(nanoLC-QE)技術(shù)對PC3-Ⅲ進行定性分析,然而由于其基因組序列未知,我們無法知道PC3-Ⅲ的確切序列[21],盡管如此,依然對在MS分析中顯示出的高信號強度肽進行了測序,使用Mascot2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫,查庫得到的3個肽段的序列分別為QYSINFISAR、CNGDSCVCTFR和SNNFR(表1),結(jié)果顯示PC3-Ⅲ對同源蛋白A0A0M3STY1(https://www.uniprot.org/uploadlists/)的覆蓋率達到35%,圖9C為其二級質(zhì)譜圖。

表1 由Q-Exactive質(zhì)譜儀鑒定的PC3-Ⅲ肽片段的信息

注:A.RP-HPLC分析;B.SDS-PAGE分析;C.QE序列分析二級質(zhì)譜圖

4 討論

本文基于抑制肝異常細胞增殖的細胞評價技術(shù)來篩選土鱉蟲中的活性成分。利用肝癌細胞SMMC-7721考察樣品EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC在體外抗肝癌活性。采用細胞因子TGF-β激活HSC-T6細胞考察樣品EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC在體外抑制肝纖維化的作用。目前認為大鼠肝星狀細胞的活化和增殖是導(dǎo)致肝纖維化的關(guān)鍵過程。在正常情況下,肝星狀細胞處于靜止狀態(tài),不表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA),增殖活性低；當它激活后,通過增殖和分泌細胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成。肝纖維化是肝星狀細胞激活和隨后過量的細胞外基質(zhì)(ECM)沉積的結(jié)果[22]。

篩選得到活性蛋白部位EEPC及活性蛋白成分PC3-Ⅲ,體外細胞實驗表明它們具有體外抗肝癌及延緩肝纖維化進程的活性。腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者死亡的原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程,腫瘤細胞遷移和侵襲是2個關(guān)鍵步驟[23]。而EEPC及PC3-Ⅲ通過抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞遷移來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抗肝癌藥效。EEPC及PC3-Ⅲ能通過抑制活化的HSC-T6細胞增殖來延緩肝纖維化的進程?；钚缘鞍壮煞諴C3-Ⅲ的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析通過電泳、HPLC及LC-MS/MS得到揭示。

總體而言,EEPC及PC3-Ⅲ具有潛在的抗肝癌及延緩肝纖維化病變的應(yīng)用開發(fā)價值,值得進一步深入研究。