陳曉娟 曹 鑫 薛理丹 宋 愈

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病患者較早發(fā)生的眼部并發(fā)癥，也是致盲的主要原因之一[1]。與年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)相比，糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病更早、進(jìn)展更快[2]。長(zhǎng)期慢性的高糖刺激能夠改變晶狀體滲透壓，引起活性氧異常積聚，誘發(fā)晶狀體氧化應(yīng)激反應(yīng)，繼而導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)發(fā)生凋亡和自噬等一系列變化，最終形成白內(nèi)障[3-4]。持續(xù)的高血糖會(huì)造成機(jī)體內(nèi)分泌和代謝紊亂，致使糖尿病性白內(nèi)障患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率要高于ARC患者[5]。因此，基于糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制尋找能夠從源頭預(yù)防其發(fā)生或延緩其進(jìn)展的分子靶點(diǎn)迫在眉睫。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種含有HMG-box結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白，在免疫、炎癥、凋亡和自噬等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明HMGB1在糖尿病及其并發(fā)癥的致病過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色[7-9]。然而，有關(guān)HMGB1在糖尿病性白內(nèi)障進(jìn)展過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制報(bào)道較少。本研究擬檢測(cè)HMGB1在糖尿病性白內(nèi)障患者和ARC患者晶狀體前囊膜以及高糖和正常糖條件下培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞株(SRA01/04)中的表達(dá)情況，分析HMGB1的表達(dá)變化對(duì)高糖誘導(dǎo)的LEC凋亡及自噬的影響，以期為糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制研究和防治措施開(kāi)發(fā)提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 晶狀體前囊膜標(biāo)本來(lái)源選取2021年10月至2022年3月在南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科確診為白內(nèi)障的患者20例，依據(jù)白內(nèi)障類(lèi)型分為糖尿病性白內(nèi)障組(DC組)和ARC組，每組各10例，取患者晶狀體前囊膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。兩組患者的年齡(P=0.70)和性別構(gòu)成(P=0.66)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。患者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)DC組：經(jīng)眼科診斷為白內(nèi)障，經(jīng)內(nèi)分泌科診斷為2型糖尿病；年齡為50～80歲；排除其他誘因?qū)е碌陌變?nèi)障，如外傷性、藥物性白內(nèi)障等；排除高度近視、葡萄膜炎、青光眼等具有其他眼病史及眼科手術(shù)史；排除具有心血管疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)等對(duì)全身代謝影響較大的疾病。(2)ARC組：無(wú)糖尿病病史，其他入組標(biāo)準(zhǔn)同DC組。本研究遵循《赫爾辛基宣言》的原則，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前已對(duì)所有參與者闡明本研究目的和方法，并簽署書(shū)面的知情同意書(shū)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源和試劑人晶狀體上皮細(xì)胞株(SRA01/04)(日本理化學(xué)研究所)，正常糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(阿根廷Natocor公司)，HMGB1抗體(11000)、Bax抗體(11000)、Bcl-2抗體(11000)、LC3B抗體(11000)、p62抗體(11000)(英國(guó)Abcam公司)，Trizol試劑、Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)，引物、siRNA(中國(guó)銳博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 晶狀體前囊膜標(biāo)本收集所有患者均由同一手術(shù)醫(yī)師行超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)+人工晶狀體植入術(shù)，通過(guò)環(huán)形撕囊，收集晶狀體中央前囊膜(含LEC)。置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與高糖處理將SRA01/04細(xì)胞培養(yǎng)于含青鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)10%FBS的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。選用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為正常糖組和高糖組，正常糖組培養(yǎng)基含5.5 mmol·L-1葡萄糖，高糖組培養(yǎng)基含25.0 mmol·L-1葡萄糖，處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 晶狀體前囊膜標(biāo)本及SRA01/04細(xì)胞蛋白提取晶狀體前囊膜蛋白提?。簭?80 ℃冰箱中取出前囊膜組織，按前囊膜質(zhì)量與蛋白裂解液體積1 mg10 μL的比例，加入相應(yīng)體積蛋白裂解液，于4 ℃搖床裂解1 h，離心后收集上清。細(xì)胞蛋白提?。簩⒓?xì)胞置于冰上，加入適量蛋白裂解液，冰上裂解10 min后將細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃裂解1 h，離心后收集上清。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁固定后將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、scr-siRNA組和si-HMGB1組。正常對(duì)照組：不作任何處理；scr-siRNA組：加入等量的Lipofectamine 3000和scr-siRNA；si-HMGB1組：加入等量的Lipofectamine 3000和si-HMGB1。三組細(xì)胞均用含5.5 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，隨后提取RNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。將細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖組、高糖組、高糖+scr-siRNA組、高糖+si-HMGB1組。高糖+scr-siRNA組、高糖+si-HMGB1組細(xì)胞按上述方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待收集細(xì)胞前24 h，正常糖組細(xì)胞用含5.5 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組、高糖+scr-siRNA組、高糖+si-HMGB1組細(xì)胞用含25.0 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)。HMGB1 siRNA序列：正向?yàn)?’-GGCUUUCACUUAAGAACUUTF-3’，反向?yàn)?’-AAGUUCUUAAGUGAAAGCCTF-3’；非特異性siRNA(scr-siRNA)序列：正向?yàn)?’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向?yàn)?’-ACGUGACACGUUCGGAGAATY-3’。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)每孔加入20 μg上述蛋白，采用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳(電壓80 V轉(zhuǎn)120 V)，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法(電流250 mA，2 h)將靶蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天，經(jīng)二抗室溫孵育2 h后，于暗室內(nèi)進(jìn)行顯影。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)HMGB1 mRNA的表達(dá)情況采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以β-actin為內(nèi)參，比較各組細(xì)胞HMGB1和β-actin的Ct值，采用2-△△Ct分析HMGB1 mRNA表達(dá)情況。HMGB1基因序列：正向?yàn)?’-GAGCATAAGAAGAAGCACCCAGAT-3’，反向?yàn)?’-GGGCGATACTCAGAGCAGAAG-3’；β-actin基因序列：正向?yàn)?’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，反向?yàn)?’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。

1.2.7 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況將細(xì)胞接種于預(yù)先放置細(xì)胞爬片的24孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。用40 g·L-1多聚甲醛室溫固定1 h，冰上靜置細(xì)胞5 min。按說(shuō)明書(shū)要求配置TUNEL檢測(cè)液。每孔加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃孵育1 h。加入經(jīng)PBS稀釋的Hoechst，室溫避光孵育8 min。用封片劑封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍攝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制圖表。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組晶狀體前囊膜和SRA01/04細(xì)胞HMGB1蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：DC組患者晶狀體前囊膜HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.18±0.02，高于ARC組(1.00±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)；高糖組SRA01/04細(xì)胞中HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量同樣高于正常糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

2.2 HMGB1敲降效率的驗(yàn)證qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：si-HMGB1組SRA01/04細(xì)胞HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于scr-siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；正常對(duì)照組和scr-siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖1 兩組患者晶狀體前囊膜HMGB1蛋白的表達(dá)情況 兩組相比，***P<0.001。

圖2 兩組SRA01/04細(xì)胞HMGB1蛋白的表達(dá)情況 1表示正常糖組，2表示高糖組；兩組相比，***P<0.001。

圖3 各組SRA01/04細(xì)胞HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 兩組相比，***P<0.001，ns表示P>0.05。

2.3 HMGB1敲降后對(duì)高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡和自噬的影響

2.3.1 HMGB1敲降后可抑制高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡為了探討HMGB1在高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡中的作用，本研究采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(Bax和Bcl-2)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，高糖組SRA01/04細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平高于正常糖組，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平低于正常糖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。敲降HMGB1后，高糖+si-HMGB1組SRA01/04細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平低于高糖+scr-siRNA組，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平高于高糖+scr-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖4)。TUNEL實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，抑制HMGB1的表達(dá)可減少高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡(圖5)。

圖4 Western blot檢測(cè)HMGB1敲降后各組SRA01/04細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax和Bcl-2)的表達(dá) 兩組相比，*P<0.05，**P<0.01。1、2、3、4分別表示正常糖組、高糖組、高糖+scr-siRNA組、高糖+si-HMGB1組。

圖5 TUNEL法檢測(cè)HMGB1敲降后各組SRA01/04細(xì)胞凋亡情況(×100)

2.3.2 HMGB1敲降后可抑制高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞自噬為了研究HMGB1在高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞自噬中的作用，本研究同樣采用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(LC3II和p62)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：高糖組SRA01/04細(xì)胞LC3II的表達(dá)水平高于正常糖組，而p62的表達(dá)水平低于正常糖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；HMGB1敲降后，高糖+si-HMGB1組SRA01/04細(xì)胞LC3II的表達(dá)水平低于高糖+scr-siRNA組，而p62的表達(dá)水平高于高糖+scr-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖6)。這提示HMGB1的減少可抑制高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞自噬。

圖6 Western blot檢測(cè)HMGB1敲降后各組SRA01/04細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(LC3II和p62)的表達(dá) 兩組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。1、2、3、4分別表示正常糖組、高糖組、高糖+scr-siRNA組、高糖+si-HMGB1組。

3 討論

隨著物質(zhì)生活水平的提高，糖尿病患者人數(shù)呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。人口老齡化以及患者預(yù)期壽命的延長(zhǎng)意味著糖尿病的患病率到2050年將超過(guò)33%[10]。作為糖尿病最常見(jiàn)的眼部并發(fā)癥之一，糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病率也在逐年增高。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者白內(nèi)障的患病率是正常人群的5倍，平均提前10年發(fā)病[11]。持續(xù)的高糖刺激可致晶狀體在內(nèi)的各種眼部組織發(fā)生病理學(xué)改變[12]。葡萄糖通過(guò)醛糖還原酶轉(zhuǎn)化為山梨糖醇，卻難以繼續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)楣牵纱诵纬傻母邼B環(huán)境誘導(dǎo)LEC發(fā)生一系列功能變化(凋亡和自噬等)，引起細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致晶狀體混濁[13-14]。因此，了解高糖對(duì)LEC生存的影響及其具體機(jī)制至關(guān)重要。在本研究中，我們以糖尿病性白內(nèi)障患者和高糖條件下培養(yǎng)的SRA01/04細(xì)胞作為研究對(duì)象，旨在尋找能夠防治糖尿病性白內(nèi)障的潛在分子靶點(diǎn)。

HMGB1是一種高度保守的蛋白，廣泛分布于心、腦、眼等組織中[15]。近年來(lái)，大量研究表明，HMGB1與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)。Yan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者血清中的HMGB1表達(dá)更高。Wang等[17]通過(guò)大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠大腦中HMGB1的分泌增加，且缺血也可誘導(dǎo)糖尿病大鼠大腦分泌HMGB1，提示HMGB1有望成為糖尿病患者缺血后損傷的治療靶點(diǎn)。Liang等[18]通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HMGB1與IκB相互作用，通過(guò)NF-κB通路參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展。此外，作為一種與損傷相關(guān)的分子模式蛋白，HMGB1在糖尿病小鼠角膜中的表達(dá)顯著升高，抑制HMGB1表達(dá)可促進(jìn)糖尿病眼損傷后角膜上皮的恢復(fù)[19]。總之，以上結(jié)果均提示HMGB1在糖尿病的發(fā)病以及糖尿病并發(fā)癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在DC組和高糖組組織或細(xì)胞中表達(dá)均升高，提示HMGB1也可能參與調(diào)控糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1表達(dá)可通過(guò)激活A(yù)MPK通路和減輕線粒體功能障礙來(lái)減少高糖誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡。Jiang等[21]通過(guò)向鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射HMGB1 siRNA發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少，視網(wǎng)膜功能得以改善。這些結(jié)果表明，HMGB1表達(dá)下調(diào)可能對(duì)細(xì)胞起一個(gè)保護(hù)性作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖可促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞凋亡，而HMGB1敲降后細(xì)胞凋亡減少，提示HMGB1表達(dá)下調(diào)能顯著抑制高糖介導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡。

自噬是細(xì)胞內(nèi)受損蛋白或細(xì)胞器經(jīng)自噬小泡包裹后送入溶酶體中進(jìn)行降解的另一種細(xì)胞程序性死亡過(guò)程。研究顯示，HMGB1介導(dǎo)的自噬可在不同的疾病中發(fā)揮不同的功能。例如，Chen等[22]發(fā)現(xiàn)，HMGB1的減少可通過(guò)抑制自噬通量來(lái)減輕糖尿病小鼠的心肌缺血-再灌注損傷。而Chung等[23]用英夫拉色烯抑制HMGB1表達(dá)，細(xì)胞自噬受到抑制，細(xì)胞功能發(fā)生障礙，繼而引發(fā)糖尿病。由此可見(jiàn)，HMGB1介導(dǎo)的自噬具有雙重作用。本研究結(jié)果顯示，高糖可激活自噬，當(dāng)抑制HMGB1表達(dá)時(shí)，自噬水平降低。此外，已有研究表明，細(xì)胞在應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激時(shí)，凋亡和自噬之間的協(xié)同作用是維持細(xì)胞正常功能的重要機(jī)制[24]。過(guò)度自噬或毒性自噬可通過(guò)溶酶體釋放促凋亡蛋白來(lái)加速細(xì)胞凋亡或通過(guò)組織蛋白酶增加線粒體膜通透性激活半胱天冬酶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。鑒于此，我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索HMGB1在高糖介導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡和自噬之間的具體調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，HMGB1可能通過(guò)調(diào)控LEC凋亡和自噬過(guò)程來(lái)參與糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展，該結(jié)論有望為糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制和防治策略研究提供新的分子靶點(diǎn)。