李奎，魏代巍，李姝琪，張惠玲*

1(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川，750021)2(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川，750021)

馬鈴薯在中國的種植面積及產(chǎn)量是全世界之首，歷年來是我國最重要的糧食作物之一[1]。在歐美國家和地區(qū)，馬鈴薯一直是主食，例如最常見的炸薯?xiàng)l就是最典型的主食，在我國，主要以小麥大米雜糧作為主食，馬鈴薯仍然作為蔬菜來食用[2-3]。于是農(nóng)業(yè)部在2015年提出馬鈴薯主糧化的戰(zhàn)略性政策，其實(shí)現(xiàn)手段是把馬鈴薯加工成饅頭、面條、米粉等傳統(tǒng)主食[4]。而馬鈴薯淀粉中的快消化淀粉(rapidly digested starch，RDS)含量較高，將馬鈴薯作為原料制備則會(huì)進(jìn)一步增加饅頭升糖指數(shù)(glycemic index, GI值)[5-6]不利于糖尿病人群的食用，正常人群長期食用也可能會(huì)因?yàn)楦逩I值誘發(fā)糖尿病，所以如何開發(fā)低GI馬鈴薯主食產(chǎn)品問題亟待解決。

近年來，越來越多的科研工作者將目光聚焦到原花青素輔助治療糖尿病方面的研究。原花青素不僅能夠抑制人體內(nèi)糖基化晚期終產(chǎn)物的形成[7]，還能有效抑制碳水化合物消化過程中起關(guān)鍵作用的水解酶的活性，如α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶，能夠減緩食物的水解進(jìn)程，避免餐后體內(nèi)血糖急劇升高，從而實(shí)現(xiàn)糖尿病預(yù)防和輔助治療的作用。有研究表明稱，不同來源的原花青素對淀粉的消化影響不同[8]。郭雅靖等[9]研究了葡萄籽、高粱麩皮、蔓越莓和蘋果中的原花青素對α-淀粉酶活性的影響，結(jié)果表明,這4種物質(zhì)中的原花青素對α-淀粉酶活力都有著抑制作用，其中葡萄籽和高粱麩皮中的原花青素對α-淀粉酶活力的抑制作用更明顯。MATSUI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，松樹皮中的多酚物質(zhì)主要是原花青素，其原花青素對α-葡萄糖苷酶活性是有抑制作用的。前期研究表明，龍眼皮原花青素能顯著抑制α-淀粉酶活性，其抑制類型為非競爭型可逆抑制[11]。劉承毅等[12]研究了油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性抑制作用,研究表明純化后原花青素對α-淀粉酶活性的抑制率可達(dá)到95.36%，抑制類型是可逆競爭性抑制。ZHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)原花青素A1-丙酮縮合物對α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制活性。最近研究表明葡萄籽原花青素能與馬鈴薯淀粉形成復(fù)合物，抑制馬鈴薯淀粉的消化[14]。

目前對于淀粉消化性的研究主要集中于純淀粉，而在真實(shí)食品體系中，淀粉的結(jié)構(gòu)往往隨加工條件發(fā)生改變，淀粉與食品中其他物質(zhì)的相互作用及其對食品基質(zhì)的影響十分復(fù)雜。本文將馬鈴薯淀粉與歐李原花青素制備成復(fù)合體，通過分析其結(jié)構(gòu)、理化和消化特性探究歐李原花青素抑制馬鈴薯淀粉消化的機(jī)理，為原花色素類物質(zhì)調(diào)控馬鈴薯淀粉的消化提供一些新思路，能夠針對性開發(fā)適合特殊人群的膳食。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，青薯9號，來自寧夏固原；歐李，農(nóng)大4號，來自寧夏中衛(wèi)；無水乙醇、甲醇、鹽酸，麥克林公司；醋酸鈉，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；石油醚、磷酸鹽緩沖液，天津市化學(xué)試劑一廠；3,5-二硝基水楊酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；豬胰α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、D-葡萄糖試劑盒，上海麥克林生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)DF-Ⅱ、數(shù)顯集熱式磁力攪拌器DF-Ⅱ，常州愛華儀器制造有限公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜，美國熱電尼高力公司；D8-ADVANCE X-射線衍射儀，德國BRUKER公司；EVO18掃描電子顯微鏡，北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司；V-5100紫外可見分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；PHS-2C高速冷凍離心機(jī)，杭州奧利龍儀器有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；GL-88B旋渦混合器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 馬鈴薯淀粉制備

選用新鮮的馬鈴薯(青薯9號)，清洗去泥去皮，切成小塊，放入研缽中搗碎，加水，再用紗布進(jìn)行過濾，用水沖洗，濾渣重復(fù)上述操作。將過濾到盆中的淀粉乳液靜置數(shù)小時(shí)，倒出上清液，加水?dāng)嚢瑁俅戊o置數(shù)小時(shí)。用布式漏斗減壓抽濾后得到濕淀粉，把濕淀粉用60 ℃烘箱烘干，最終得淀粉制品。

1.3.2 歐李原花青素-馬鈴薯淀粉混合物制備

準(zhǔn)確稱取500 mg的馬鈴薯淀粉于離心管中，分別按淀粉質(zhì)量的0%、1.0%、2.0%和3.0%稱取原花青素0、5、10、15 mg加入到離心管中，再加入9 mL的去離子水，混勻，于恒溫水浴鍋中糊化，95 ℃下糊化20 min，取出冷卻至室溫，置4 ℃冰箱內(nèi)7 d，然后在-20 ℃冰箱中預(yù)凍4 h后進(jìn)行冷凍干燥，干燥后的樣品用研缽研磨成細(xì)粉，過100目篩，置于干燥容器內(nèi)備用。

1.3.3 原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察

SEM檢測條件：經(jīng)過離子濺射鍍膜儀將樣品鍍金，厚度為250～500 nm，在EVO18掃描電子顯微鏡中觀察顆粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)，工作電壓：3 kV、放大倍數(shù)：100倍。

1.3.4 X-射線衍射(X-ray diffraction, XRD)測定

X-射線衍射的測試條件：Cu靶，管流為40 mA，管壓為40 kv，掃描速度為2°/min，步長為2°起始角為4°，終止角為40°，進(jìn)行連續(xù)掃描。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)測定

紅外光譜檢測條件：以10 kN持續(xù)2 min。對于每個(gè)光譜，32次連續(xù)掃描和雙面在該范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率采集干涉圖室溫下為4 000～400 cm-1。

1.3.6 歐李原花青素對α-淀粉酶作用的分子模擬

采用AutoDock Vina軟件[15-16]對α-淀粉酶與歐李原花青素之間進(jìn)行分子對接模擬，用Py-Mol軟件[17]，進(jìn)行分子對接分析。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org/)中下載α-淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)，PDB編號:1UA3(豬胰-淀粉酶)。利用ChemBioDraw Ultra 14.0繪制出小分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，AutoDock Tools 軟件用于將蛋白質(zhì)和小分子格式轉(zhuǎn)化為PDBQT，在對接之前，通過去除水分子對蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理。

1.3.7 葡萄糖含量的測定

1.3.7.1 水解馬鈴薯淀粉

消化液制備：將500 mg馬鈴薯淀粉加入到8 mL的磷酸鹽緩沖劑(pH值5.2)中，在95 ℃的水浴中連續(xù)攪拌，糊化20 min，然后取出冷卻至37 ℃，再加入5 mL的酶解液。加入混合酶溶液后，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，分別于0、20、120 min取消化液0.2 mL，用1.8 mL的無水乙醇進(jìn)行滅酶處理。取上清液，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，離心10 min。

測定方法：消化液510 nm處的吸光度由D-葡萄糖試劑盒(GOPOD格式K-GLUK，Megazyme International Ireland Ltd，Wicklow，Ireland)測定。

1.3.7.2 水解原花青素-馬鈴薯淀粉混合物

消化液制備：將不同比例的原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合樣品分別加入到8 mL的磷酸鹽緩沖劑(pH值5.2)中，在95 ℃的水浴中連續(xù)攪拌且糊化20 min，然后取出冷卻至37 ℃，再加入5 mL的酶解液。加入混合酶溶液后，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，分別于0、20、120 min取消化液0.2 mL，用1.8 mL的無水乙醇進(jìn)行滅酶處理。取上清液，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，離心10 min。

測定方法：消化液在510 nm處的吸光度由D-葡萄糖試劑盒(GOPOD格式K-GLUK，Megazyme International Ireland Ltd，Wicklow，Ireland)測定。同上。

1.3.8 淀粉含量的測定

馬鈴薯淀粉和不同比例的歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物水解液分別在510 nm處的吸光度由D-葡萄糖試劑盒(GOPOD格式K-GLUK，Megazyme International Ireland Ltd，Wicklow，Ireland)測定。計(jì)算RDS、慢消化淀粉(slowly digestible starch，SDS)和抗性淀粉(resistant starch，RS)的含量，計(jì)算如公式(1)～公式(3)所示:

(1)

(2)

RS=(1-RDS-SDS)×100

(3)

式中：RDS為快消化淀粉含量，%；SDS為慢消化淀粉含量，%；RS為抗性淀粉含量，%；0.9為從淀粉到葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)，G0酶解前游離葡萄糖的量，mg；G20為酶解20 min時(shí)產(chǎn)生的葡萄糖的量，mg；G120為酶解120 min后產(chǎn)生的葡萄糖的量，mg；TS為樣品中總淀粉含量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)平均測定3次，用M±SD表示，采用SPSS 20.0、AutoDock Vina軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin、Py-Mol、Jade6、Excel進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物SEM分析

天然馬鈴薯淀粉和歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物糊化后的SEM微觀結(jié)構(gòu)圖如圖1所示， 天然馬鈴薯淀粉在老化7 d后的微觀結(jié)構(gòu)呈“石頭狀”的硬塊，表現(xiàn)出規(guī)則的多面體形態(tài)，結(jié)構(gòu)完整且棱角分明，表面較平整光滑，在添加了歐李原花青素后，表面形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，其微觀結(jié)構(gòu)變得更加緊實(shí)，表面出現(xiàn)許多網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并在一定程度上破壞淀粉凝膠的表面結(jié)構(gòu)及表面完整性，這說明原花青素與馬鈴薯淀粉共同糊化時(shí)可能發(fā)生了相互作用[18]。

a-天然馬鈴薯淀粉；b-歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物圖1 添加歐李原花青素對馬鈴薯淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of adding pomegranate proanthocyanidins on the microstructure of potato starch

2.2 歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物的XRD圖譜分析

由圖2中曲線a可知，天然馬鈴薯淀粉呈現(xiàn)出典型的B型圖案衍射峰，衍射角在5.6°、15°、17°和20°有單衍射峰，在21°和24°有一相連的雙衍射峰。但是，當(dāng)馬鈴薯淀粉添加了原花青素后，馬鈴薯淀粉的B-型結(jié)構(gòu)特征峰消失，呈現(xiàn)出與天然馬鈴薯淀粉完全不同的衍射峰(曲線b～h)，呈彌散型衍射特征，表明幾乎沒有結(jié)晶區(qū)域，可能是馬鈴薯淀粉的長距離晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞[19-20]，會(huì)造成淀粉酶與淀粉作用受到阻礙。但是，在曲線e～h中，在大約衍射角度為34°和37.4°處發(fā)現(xiàn)2個(gè)微小的新峰，考慮到天然馬鈴薯在這2個(gè)位置沒有顯示峰，說明歐李原花青素與馬鈴薯淀粉之間的相互作用可能會(huì)形成新的晶體結(jié)構(gòu)。

低添加量的原花青素(曲線b)可能主要與支鏈淀粉側(cè)鏈相互作用，抑制了部分支鏈淀粉的重結(jié)晶。但當(dāng)原花青素含量較高時(shí)(曲線h)，可充分與支鏈淀粉和直鏈淀粉進(jìn)行相互作用，這可能是其峰值強(qiáng)度和峰型變化的原因。原花青素的加入削弱了淀粉的吸收峰，降低了淀粉相對結(jié)晶度，意味著淀粉酶與其底物淀粉接觸受到影響。

a-天然馬鈴薯淀粉；b-馬鈴薯淀粉+1%原花青素；c-馬鈴薯淀粉 +2.0%原花青素；d-馬鈴薯淀粉+3.0%原花青素；e-馬鈴薯淀粉 +4.0%原花青素；f-馬鈴薯淀粉+4.5%原花青素；g-馬鈴薯淀粉 +5.0%原花青素；h-馬鈴薯淀粉+5.5%原花青素圖2 不同添加量馬鈴薯淀粉-歐李原花青素復(fù)合體系XRD圖譜Fig.2 XRD spectra of potato starch-oricidin compound system with different supplemental amounts

2.3 歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物FT-IR分析

由圖3曲線a～h可知，天然馬鈴薯淀粉和不同比例歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物在3 500～3 100 cm-1的紅外波段都顯示了1個(gè)寬帶，這可能是由于OH基團(tuán)的拉伸振動(dòng)和H鍵的吸收所致[21]。與天然馬鈴薯淀粉相比，歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物表現(xiàn)出相同的特征峰，這表明馬鈴薯淀粉與歐李原花青素之間未形成共價(jià)鍵，即淀粉與原花青素是通過非共價(jià)相互作用而連接到一起。然而隨著原花青素添加量的增加，3 500～3 100 cm-1的紅外波段強(qiáng)度增加，表明原花青素可能通過H鍵增強(qiáng)吸收。這可能是由于原花青素中存在多個(gè)羥基，當(dāng)馬鈴薯淀粉中加入原花青素后，其原花青素中的羥基和羰基通過氫鍵與淀粉的羥基結(jié)合，形成新的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)，形成抗酶解結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制酶的水解，抑制消化，隨著加入的原花青素越多，羥基越多、空間尺寸越大，其相互作用對消化性質(zhì)的抑制效果越明顯[22]。

圖3 不同添加量馬鈴薯淀粉-歐李原花青素復(fù)合體系 FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of potato starch-oricidin complex system with different supplemental levels a-天然馬鈴薯淀粉；b-馬鈴薯淀粉+1.0%原花青素；c-馬鈴薯 淀粉+2.0%原花青素；d-馬鈴薯淀粉+3.0%原花青素； e-馬鈴薯淀粉+4.0%原花青素；f-馬鈴薯淀粉+4.5%原花青素； g-馬鈴薯淀粉+5.0%原花青素；h-馬鈴薯淀粉+5.5%原花青素

2.4 歐李原花青素對α-淀粉酶作用影響

由圖4結(jié)合文獻(xiàn)[18]可知，歐李原花青素的對接位點(diǎn)位于淀粉酶蛋白結(jié)構(gòu)的疏水空腔內(nèi)。原花青素與α-淀粉酶相關(guān)活性位點(diǎn)發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，與Glu233、Asp356、Arg195側(cè)鏈形成氫鍵相互作用，與Hid305形成pi-pi堆積，與6個(gè)氨基酸有疏水相互作用，使酶結(jié)構(gòu)上的自由氨基減少，使氨基酸的側(cè)鏈封閉，阻礙與底物的結(jié)合。

圖4 歐李原花青素與α-淀粉酶分子對接圖Fig.4 Docking diagram of proanthocyanidins and α-amylase

2.5 歐李原花青素對馬鈴薯淀粉消化性質(zhì)的影響

如圖5所示，天然馬鈴薯淀粉中RDS、SDS和RS的構(gòu)成百分比為81.57%，15.69%和2.71%。通常認(rèn)為RDS會(huì)導(dǎo)致血液中葡萄糖和胰島素水平的快速升高。因此，馬鈴薯中RSD含量高可能會(huì)引起血糖急劇波動(dòng)。由圖5可以看出，在歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合體系中，隨著歐李原花青素添加量的增加，RDS含量呈下降趨勢，SDS和RS含量呈上升趨勢，在添加量為1%時(shí)，顯示RDS含量顯著下降，RS含量顯著上升，分別為73.24%和13.32%。但是SDS的含量沒有受到顯著影響，為15.73%。隨著原花青素添加量的增加，RDS含量顯著降低，從73.24%下降到43.37%，而SDS和RS含量顯著升高，SDS從15.73%升高到35.18%，RS從13.32%升高到24.16%。

圖5 馬鈴薯淀粉和歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物消化性質(zhì)Fig.5 Digestive properties of potato starch and oleum proanthocyanidin-potato starch complex

3 結(jié)論

通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合物內(nèi)部形成許多網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其微觀結(jié)構(gòu)變得更加緊實(shí)，使馬鈴薯淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化；通過XRD分析得出，歐李原花青可能改變了馬鈴薯淀粉的晶型結(jié)構(gòu)。在歐李原花青素-馬鈴薯復(fù)合物中低添加量的原花青素抑制了部分支鏈淀粉的重結(jié)晶，在歐李原花青素-馬鈴薯復(fù)合物中，高添加量的歐李原花青素與馬鈴薯淀粉之間的相互作用可能會(huì)形成新的晶體結(jié)構(gòu)；通過FT-IR分析得出，在歐李原花青-馬鈴薯淀粉復(fù)合物中歐李原花青素可能通過非共價(jià)相互作用特別是氫鍵與馬鈴薯淀粉結(jié)合，且隨著歐李原花青-馬鈴薯淀粉復(fù)合物中歐李原花青素增加其相互作用對消化性質(zhì)的抑制效果越明顯。歐李原花青素與α-淀粉酶相關(guān)活性位點(diǎn)發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，與Glu233、Asp356、Arg195側(cè)鏈形成氫鍵相互作用，與Hid形成pi-pi堆積，與6個(gè)氨基酸有疏水相互作用，使酶結(jié)構(gòu)上的自由氨基減少，使氨基酸的側(cè)鏈封閉，阻礙與底物的結(jié)合，抑制了酶活性。通過體外消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，在歐李原花青素-馬鈴薯淀粉復(fù)合體系中，隨著歐李原花青素含量的增加，RDS含量顯著降低，而SDS和RS含量顯著升高。這是因?yàn)闅W李原花青素會(huì)與馬鈴薯淀粉形成無定形復(fù)合物的無規(guī)則構(gòu)型，增加了空間淀粉酶結(jié)合位阻，進(jìn)而減緩而不是阻止馬鈴薯淀粉的水解。